原创《核苷酸A对牙鲆巨噬细胞吞噬活力的影响》
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核苷酸A对牙鲆巨噬细胞吞噬活力的影响
赵超
（山东省莱西市渔业技术推广站山东莱西266600）
摘 要：本试验在相同的条件下,采集牙鲆巨噬细胞,用添加不同浓度的核苷酸（0、10μg/mL、1000μg/mL、10000μg/mL）的培养基对牙鲆头肾巨噬细胞进行培养,培养24小时后,进行吞噬指数的测定,以检测不同浓度的核苷酸对牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力的影响.试验结果表明,核苷酸A能够增强牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力,在设定核苷酸浓度的范围内,含10000μg/mL核苷酸的培养基对牙鲆头肾巨噬细胞的吞噬活力影响最大.
关键词：核苷酸；牙鲆；巨噬细胞；吞噬活力
核苷酸(Nucleotides,NT)是遗传物质核酸的基本结构单位,是生物体的基本组成物质,也是蛋白质合成必需的中间体的基本单位,具有编码遗传信息、调节能量代谢和传递细胞信号、作为辅酶等重要的生理生化功能.
核苷酸长期以来一直被视为非必需的营养素.然而随着研究的不断深入,人们发现核苷酸是一种很有发展前途的饲料添如剂,外源核苷酸添加到水产动物饲料中,具有多种作用.
核苷酸可以作为一种生长调节剂,饲料中添加核苷酸能够加快鱼类胃肠道等消化器官的生长发育,减少鱼类从头合成核苷酸时的耗能.同时核苷酸还能促进肠道微生物菌群的生长繁殖和促进脂肪代谢.
核苷酸可以作为一种诱食剂.其对水产动物具有很强的诱食活性.研究证明在饲料中添加丙氨酸与核苷酸的混合物对红鳍东方鲀有明显的诱食效果.
核苷酸作为一种免疫增强剂,能够增强鱼类对养殖环境的耐受性,从而使鱼类疾病抵抗力加强,死亡率降低.鱼类疾病抵抗力的提高与外源核苷酸增强鱼体免疫能力有关.
通过饲料中添加外源核苷酸,动物的特异性和非特异性免疫反应受到刺激,进而与免疫有关细胞的发生与分化以及巨噬细胞、辅助性T细胞的活性与数量及其分泌的白细胞介素受到影响,从而导致白细胞吞噬能力和杀菌能力增强,最终影响到细胞免疫.目前在集约化养殖条件下,鱼面临着多种应激条件.接种疫苗、分级筛选、网箱变化和盐度升降等生理性的应激都能诱导鱼类释放皮质醇从而使其免疫功能受抑制,进而降低饲料摄食率、生长率和疾病抵抗力.而一些学者研究证明,接种疫苗和感染疾病后的免疫细胞分化需要额外补充核苷酸.陈忠科等发现RNA及其降解物能够明显提高巨噬细胞吞噬指数、吞噬率和溶血素的溶血能力.而目前对于外源核苷酸影响机体免疫功能的机理还不是很清楚,可能是外源核苷酸进入体内的核苷酸池供白细胞利用从而提高了机体的免疫力.由于白细胞在体内的代谢周期短,因而对核苷酸的需求量大.还可能是通过促进骨髓内巨噬细胞的发育,以提高细胞和体液免疫反应能力而发挥免疫作用.
核苷酸作为一种饲料添加剂具有很好的应用前景,但是目前在外源核苷酸方面,并没有对单一的核苷酸(IMP除外)的研究,如今核苷酸在饲料中的应用还有许多问题不是很清楚,如外源核苷酸的来源、含量及其吸收与代谢机制；外源核苷酸对胃肠道的发育、机体免疫功能的影响和核苷酸添加量等,其中添加剂量一直是免疫增强剂研究的一个焦点.
牙鲆是鲽形目中一种底栖肉食性鱼类,其饵料多为低质杂鱼,沿海均产之,黄海、渤海产量较多.由于其具有生长快、肉质嫩、高蛋白、低脂肪、易消化、富含维生素等特点,因而成为海产鱼类中重要的捕捞对象.目前牙鲆养成方式主要有池塘养殖、池塘网箱养殖、室内水泥池工厂化养殖及海域网箱养殖四种,其中以陆上工厂化养殖为主.但随着牙鲆养殖业的逐步发展,牙鲆疾病的发生也呈逐年递增的趋势,从而成为牙鲆养殖的重要障碍,其他不利因素如环境污染、病害频发等也严重制约着其发展.另外,饲料是保证鱼类正常生长的物质能量基础,鱼类生长的快慢直接受到饲料营养成分的比例、饲料的性状、物理品质的好坏的影响.
核苷酸作为一种饲料添加剂,影响饲料营养成分的比例,进一步影响使用饲料牙鲆的免疫力,因而我们从核苷酸A对牙鲆头肾巨噬细胞吞噬活力的影响入手,建立牙鲆核苷酸营养和免疫力之间的关系,初步探讨核苷酸调节牙鲆免疫力的机制,为通过免疫增强剂调控手段增强机体免疫保护作用,促进水生动物健康养殖提供依据,从而为以后研制更优良的牙鲆饲料等提供重要参考依据.
1材料与方法
1.1试验牙鲆及饲养管理
将牙鲆随机分配至室内海水循环系统中6个等大的水槽中,水槽上方盖白板以遮住强光,以基础饲料暂养.试验期间每天投喂一次,次日早晨吸底排污以维持水质的清洁,同时观察牙鲆饲料的摄食情况,两粒摄食完毕则当日晚上开始投喂三粒,如此投喂粒数依次增加.试验期间每天晚上同一时间用温度计测各个水槽的水温并记录.饲养期间保持连续充气,每星期换水一次,放出1/3～1/2水槽中的海水,再加入新鲜海水.
1.2试验药品的配制
1.2.1Percoll密度梯度溶液的配制
在无菌条件,分别用移液取9mLPercoll原液和1mL1.5MPBS至无菌容器中,混合均匀至生理性渗透压,得到等渗Percoll贮存液(SIP).然后取3.4mLSIP,加入6.6mLPBSA缓冲液,混合均匀得到34%的Percoll溶液；取5.1mL的SIP,加入4.9mLPBSA缓冲液,混合均匀得到51%的Percoll溶液.将得到的上述两种浓度的Percoll溶液置4℃备用.
1.2.2完全培养液的配制
将5%的FBS（胎牛血清）和200UI/mL的P/S双抗分别加到L-15培养基中,混合均匀后4℃保存备用.
1.2.BSA缓冲溶液的配制
分别取Nacl8.0g、Kcl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g于广口瓶中,定容至1L,调pH为7.4～7.6,用前需要高压灭菌.
1.3牙鲆头肾细胞的获取
1）将购买回的牙鲆暂养一段时间,解剖前猛击实验鱼头部致死,鱼体表面用75%酒精消毒,在无菌条件下将牙鲆解剖后,取出头肾组织.
2）将头肾组织中的脂肪、结缔组织和血液等杂物剔除,然后用完全培养基将头肾清洗三次.
3)将清洗后的头肾组织置于培养皿上的100目的灭菌筛绢上,用弯头镊子轻轻挤压头肾组织,使之通过网孔,得到细胞悬液,然后用100目的尼龙网过滤细胞悬液,将得到的细胞放在800rpm/min低速下离心十分钟,洗涤三次后加入完全培养基重悬,得到头肾细胞悬液.
1.4牙鲆头肾巨噬细胞的分离纯化
1）将实验前配好的34%和51%两种密度的Percoll溶液,分别加到离心管中,形成的34%～51%Percoll梯度带.
2）在预先形成的34%～51%Percoll梯度带上加入细胞悬液.
3）以400g的离心力,在4℃的条件上水平梯度离心30min.
4）将位于梯度带之间的细胞收集至离心管中,加入完全培养基.
5）1200rpm/min离心5分钟清洗2～3遍,加入完全培养基重悬.
6）准备50μL的0.4%台盼蓝染液,与取出的50μL细胞悬液混合,在光学显微镜下,检验细胞成活率,并利用血球计数板快速估算细胞密度.此时死细胞由于细胞膜被破坏,细胞被染成紫蓝色,而活细胞不被染色.
巨噬细胞存活率（%）W等于活细胞总数／（活细胞总数﹢死细胞的总数）×100
根据镜检的结果,将细胞密度调整至每毫升5×106个数量级.
7）将细胞接种到96孔板中,每孔100μL,置于20℃生化培养箱中培养.
8）2h或过夜后,用预温的L-15培养基洗去未贴附的细胞后改用含不同浓度核苷酸A的培养基培养.设有4个核苷酸A浓度梯度（0、10μg/mL、1000μg/mL、10000μg/mL）,每个浓度设9个重复,同时设空白对照组（3个）和实验组（6个）,在20℃生化培养箱中培养24h后准备进一步实验.
1.5吞噬活力的测定
参照袁春涛等的方法,采用中性红检测巨噬细胞吞噬力.
1）取出之前培养的96孔细胞板,用移液从每孔中取出80μL,然后每孔中加入此O.1%的中性红溶液(Sigma)各50μL,置20℃生化培养箱中培养60min.
2）移液吸出50μL中性红溶液,然后每孔中加入浓度为0.15mol/l的PBSA缓冲液150μL,再吸出150μLPBSA缓冲液以冲洗孔中残留中性红,如此冲洗3次,直至将未被细胞吞噬的中性红除净.
3）每孔中加入体积分数各为50%的冰乙酸和乙醇的细胞裂解液150μL,混合均匀,室温静置过夜,以溶解细胞.
4）在酶标仪490nm处测OD值,结果以吸光值来表示吞噬活性的高低.
1.6数据处理
试验数据采用SPSS17.0进行单因素方差分析.
2结果与分析
实验数据进行分析后得到结果如下图（字母相同表示差异不显著）：
图1不同浓度梯度的核苷酸对巨噬细胞吞噬活力的影响
从上图我们可以看出核苷酸浓度为0μg/mL和10μg/mL的试验组与核苷酸浓度是10000μg/mL的试验组吞噬活性差异显著(P<0.05),而核苷酸浓度为0μg/mL和10μg/mL的试验组吞噬活性差异不显著(P>0.05),核苷酸浓度为1000μg/mL的试验组与以上三组的吞噬活性差异均不显著(P>0.05),所以,该核苷酸溶液能够显著提高牙鲆头肾巨噬细胞的吞噬活性((P<0.05),但是当该溶液在0μg/mL至10μg/mL的浓度范围内变化时核苷酸A溶液的浓度对牙鲆头肾巨噬细胞的吞噬活性没有影响,但当浓度变大,达到1000μg/mL时牙鲆头肾巨噬细胞的吞噬活性会显著升高.
3讨论
研究证明营养和免疫之间密切相关,通过营养调控来提高鱼类的免疫力,不仅可克服传统方法所存在的缺陷,有利于健康养殖,减少对环境的污染,保证食品的安全,而且这已经被证明是一种行之有效的方法.
体外实验法和体内实验法是用于研究鱼类营养素和免疫力之间关系的两种主要方法.本试验采用体外实验法,体外实验法是在离体条件下进行的研究.通常是以不同浓度的营养素与免疫细胞（如头肾的吞噬细胞）直接作用,以探讨营养素对吞噬细胞吞噬指数和呼吸爆发活力的影响.这种方法不仅可排除其它营养素的干扰,而且能够快速、准确地发现本试验中核苷酸A对免疫细胞免疫应答的影响.
在鱼类的免疫细胞中,吞噬细胞具有多种生物学功能,能够产生多种细胞因子,参与机体的免疫应答和免疫调节.而衡量机体非特异性免疫功能的指标之一就是其吞噬能力.鱼类非特异性细胞防御的细胞主要是巨噬细胞.当病原体等遇到巨噬细胞,被其通过吞噬或吞饮作用摄人胞内,形成吞噬体,吞噬体与溶酶体融合,在多种水解酶作用下,消化降解细菌.因此吞噬功能的强弱可以通过测定巨噬细胞对中性红的吞噬指数来反映,而吞噬活力是评价核苷酸A对牙鲆非特异性免疫系统巨噬细胞机能的影响的重要指标.
本研究结果表明,核苷酸A作为培养成分用于牙鲆离体培养的头肾巨噬细胞后,核苷酸A在浓度10mg·mL-1时(P<0·05)可以显著提高巨噬细胞的吞噬活力,表明核苷酸A在合适的作用浓度范围内,可以通过促进巨噬细胞的吞噬活力来增强机体的非特异性功能,提高抵抗力.SakaiM等用核苷酸在鲤鱼中的应用发现,外源核苷酸能增强溶菌酶的活性和巨噬细胞的吞噬作用;也有研究表明外源核苷酸能够显著提高水产动物的非特异性免疫机能,如可提高美国红鱼、石斑鱼和鲤鱼血清补体和溶菌酶活性、免疫细胞的吞噬作用和头肾巨噬细胞超氧阴离子的产生.但由于实验中单次密度梯度分离方法不能很好地将巨噬细胞分离纯化,并且细胞采集和培养过程中易被污染,因而对试验数据产生影响,数据可能有失精确性,并且不能确定达到最佳的增强免疫力的作用时的核苷酸A浓度,因而这就在应用上提出了难题,我们需要在此试验的基础上进一步深化,寻找一个最佳浓度从而为牙鲆免疫力及其饲料的研究提供参考资料.
参考文献（略）
细胞论文参考资料：
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