原创《氯化镉对不同倍性泥鳅鳍细胞系的毒性效应》
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摘 要：旨在研究不同浓度氯化镉对60~80 代二倍体和三倍体泥鳅鳍细胞系（DIMF和TRMF）的毒性效应,比较不同倍性细胞系间的敏感性差异.采用MTT比色法测定半致死浓度,采用酶活力测定法、微核试验和实时定量PCR法测定了氯化镉对2 种细胞系的细胞毒性和遗传毒性.结果表明：氯化镉处理下DIMF、TRMF细胞系半致死浓度分别为(24.0&plun;0.7)、(27.3&plun;1.3) μmol/L.2 种细胞系的SOD、GSH-Px活性随着氯化镉浓度的增加,呈现先升高后降低的趋势,而GST活性则表现为逐渐降低.随着氯化镉浓度的增加微核率先升高后降低,DIMF、TRMF最大微核率分别为(7.33&plun;0.33)‰、(8.33&plun;0.67)‰.经氯化镉处理的细胞金属硫蛋白(MT)表达量显著增加,30 μmol/L 浓度组表达量最大,分别为对照组的55.6 和57.6 倍.研究表明,氯化镉对泥鳅二倍体和三倍体细胞系具有细胞毒性和遗传毒性,且二倍体细胞系较三倍体细胞系对氯化镉更为敏感.
关键词：氯化镉；泥鳅；细胞系；酶学；微核率；金属硫蛋白
中图分类号：Q256 文献标志码：A 论文编号：cjas16110016
0 引言
随着水生环境中重金属污染问题的日益突出,有关重金属引起的毒理学研究受到关注.选择适宜的检测生物成为毒理学研究的重要内容之一.鱼类作为水环境中重金属污染检测生物的报道较多[1].如在中国分布广泛的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),存在着天然的多倍体形态,是良好的急性毒性实验材料[2-3].但鱼类自身具有排毒和免疫能力,不能敏感地监测出有毒物质[4-6].体外培养的细胞系具有均一性好、无个体间差异、细胞与污染物直接接触、反应迅速、观察方便的特点[7].Rachlin[8]最早将鱼类细胞系用于毒理学实验,此后不断有研究者利用不同鱼类细胞系探究环芳香族碳水化合物[9]、重金属[10-12]、除草剂[13]、杀虫剂[14]、药物[15]的毒性机理.
镉是中国水生生态系统中常见的重金属污染物,是水生动物的非必需元素,目前已知镉能通过与酶类巯基结合或通过竞争或非竞争性替代作用,置换出细胞内金属依赖性酶类,特别是抗氧化酶系中的金属辅基,影响细胞的正常代谢.但镉对细胞遗传损伤相关的研究主要是在个体水平所做的工作[16-17],尚未有利用细胞系进行的研究.笔者以本实验室建立的二倍体、三倍体泥鳅鳍细胞系为实验材料,研究了镉对细胞的毒性效应,为建立适合检测镉污染的细胞模型打下基础,此外还比较了不同倍性细胞系对镉的敏感性,丰富了鱼类多倍体理论研究.
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用的泥鳅二倍体鳍细胞系(DIMF)、三倍体泥鳅鳍细胞系(TRMF)是大连海洋大学细胞工程实验室2012 年建立的.细胞系所用的培养基均为含20%胎牛血清的DMEM/F12,25℃,5% CO2条件下培养.实验所用DMEM/F12 培养基、胎牛血清、胰酶均为Hyclone 公司生产；氯化镉、MTT、DMSO等购置于上海生物工程有限公司；酶学检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；实时定量所用试剂盒来自于北京全式金生物技术有限公司.
实验在大连海洋大学细胞工程实验室,于2014 年9月—2015年6月进行
1.2 实验方法
1.2.1 染毒处理设置氯化镉浓度分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L.取生长良好的60~80 代DIMF、TRMF,以1×105 个/mL 密度接种于96 孔板或25 mL 培养瓶中,接种量分别为0.2 mL 和5 mL,24 h后,弃去原培养基,加入等体积含不同浓度氯化镉的培养基,每个浓度设3个平行,培养24 h后用于实验.1.2.2 MTT测定细胞存活率染毒24 h 后,加入40 μL的5 mg/mL 的MTT 于96 孔板中,孵育4 h,弃去培养基,用PBS 缓冲液快速清洗2 次,加入150 μL DMSO震荡10 min,在酶标仪570 nm处测定吸光值.其中氯化镉浓度为0 的为阳性对照组,另设一组只加等体积培养基不加细胞的为阴性对照组.细胞存活率计算见公式(1).
1.2.3 酶活力检测收集染毒24 h 的细胞于离心管中,1500 r/min 离心5 min,用PBS 重悬沉淀,在冰水浴中用超声破碎仪破碎细胞,工作3 s,间隙3 s,处理100 次后,按照南京建成试剂盒说明书测定酶活力变化.
1.2.4 微核率测定及统计收集染毒24 h细胞于离心管中,1000 r/min 离心5 min,用0.5 mL PBS 重悬沉淀,参考李霞等[18]的方法滴片、推片、甲醇固定、姬姆萨染色、蒸馏水冲洗、自然晾干、中性树胶封片、油镜观察.微核率计算见公式(2).
1.2.5 金属硫蛋白测定以泥鳅Actinβ基因为内参,参照王磊[19]的报道设计引物如下：
Actinβ-F：5´-GAACTCTTGCCACCATACCTG-3´
Actinβ-R：5´-CCCAAGTCAATGCGTCAGAG-3´
MT-F：5´-AATGTGAACTCTTTGTCCGAAC-3´
MT-R：5´-GGAGGCAAGTGAAACCCAAC-3´
收集染毒细胞,1000 r/min 离心5 min,用1 mLPBS 重悬细胞,然后按照常规TRIzol 方法提取细胞总RNA,检验RNA完整性、浓度和纯度,用DEPC Water调整RNA 浓度为500 ng/μL.按照全式金试剂盒说明,反转录成cDNA第一条链,以反转录出来的cDNA为标准品,10 倍梯度稀释为模板,按照全式金说明书,分别制作内参基因Actinβ和目的基因MT的标准曲线,并进行Real-time PCR.另设一组不加cDNA模板,以ddH2O 补足的体系为阴性对照.反应体系为：模板1 μL,上下游引物各0.4 μL,2×TransScript?Top GreenqPCR SuperMix 10 μL；Passive Reference Dye (50 × )0.4 μL；ddH2O 7.8 μL.反应条件为：94℃ 30 s；94℃ 5 s,60℃ 30 s,40循环,结果以ΔΔCt法计算.1.2.6 数据处理实验数据用SPSS 17.0 软件分析,结果以平均值&plun;标准差表示,P<0.05 定义为差异显著,P<0.01定义为差异极显著,用Origin 8.5软件作图.
2 结果与分析
2.1 半致死浓度的确定
以不同浓度的氯化镉处理泥鳅鳍细胞系24 h后,存活率变化如图1.从图1中可以看出2种细胞变化规律基本一致,随着氯化镉浓度的增加,细胞存活力逐渐降低,细胞存活率与染毒浓度有依赖关系,存活率与浓度的自然对数剂量效应方程分别为：y等于-45.24lnx+193.87(R2等于0.984)和y等于-45.97lnx+198.67 (R2等于0.986),根据方程可知DIMF的半致死浓度为(24.0&plun;0.7) μmol/L,当浓度达到70 μmol/L 时全部死亡；TRMF 的半致死浓度为(27.3&plun;1.3) μmol/L,当浓度达到80 μmol/L时全部死亡.
2.2 酶活力变化
不同浓度的氯化镉处理细胞系24 h 后SOD 活性变化如图2,当氯化镉浓度为0~20 μmol/L 时,DIMF和TRMF 细胞系的酶活性随染毒浓度的增加而升高,20 μmol/L 氯化镉浓度组SOD活性最高,分别为40.5、50.6 U/mg prot,与对照组存在极显著差异(P<0.01),相同染毒浓度,TRMF的SOD活性要高于DIMF.
氯化镉处理24 h 后GSH-Px 活性变化如图3,GSH-Px 活性随氯化镉浓度的升高,呈现先升高后降低的趋势,10 μmol/L氯化镉浓度组GSH-Px活性最高,分别为43.7、68.8 U/mg prot,与对照组存在极显著差异(P<0.01).GSH-Px的活力顺序为DIMF<TRMF.
染毒24 h 后,随着氯化镉浓度的逐渐升高,2 种细胞的GST活性均呈现降低的趋势,见图4.
2.3 微核率的变化
经氯化镉处理后,DIMF、TRMF中均有微核出现,微核颜色与细胞核相同,呈圆形（图5）.由表1 可见,当氯化镉浓度在0~30 μmol/L 时,DIMF的微核率随镉浓度的升高而升高,当氯化镉浓度为30 μmol/L 时,微核率达到最大,为7.33‰；当氯化镉浓度在0~40 μmol/L时,TRMF的微核率随镉浓度的升高而升高,当氯化镉浓度达到40 μmol/L 时,微核率达到最大,为8.33‰.氯化镉浓度相同的情况下,DIMF 微核率低于TRMF.
2.4 MT表达量的变化
MT mRNA相对表达量的实验结果见图6.泥鳅鳍细胞系MT在无重金属刺激下表达量很低,10 μL的氯化镉就可刺激MT mRNA大量表达(P<0.01),在氯化镉浓度为30 μL达到最大值(P<0.01),分别为对照组的55.6、57.6 倍,此后表达量有所下降,但仍极显著高于对照组(P<0.01).2个细胞系间没有显著性差异.
3 结论
利用MTT法得出了泥鳅二倍体和三倍体细胞系对氯化镉的半致死浓度,表明两个细胞系对氯化镉比较敏感.较低浓度(0~20μmol/L)的氯化镉可以激活2种细胞系的抗氧化系统,也会导致微核率的升高,金属硫蛋白表达量升高,但高浓度的氯化镉则超出了抗氧化系统所能调节的范围,也会直接导致细胞死亡,金属硫蛋白表达量随即下降.综合来看,氯化镉处理下,二倍体较三倍体细胞系更为敏感.
4 讨论
4.1 氯化镉对细胞存活率的影响
本实验中DIMF、TRMF半致死浓度为(24.0&plun;0.7)、(27.3&plun;1.3) μmol/L,与谭凤霞等[12]报道的氯化镉对稀有鮈卿鳍条细胞系的半致死浓度(23&plun;4.4) μmol/L 相近,说明实验中所用的二倍体、三倍体细胞系对氯化镉的反应比较敏感,可用于镉污染的监测以及毒理学研究.
4.2 氯化镉对抗氧化酶活力的影响
Cd2+可以改变抗氧化酶的活力,降低细胞对自由基及其产物的清除能力[19].SOD是细胞中关键的抗氧化酶,可清除重金属诱导的氧自由基,从而保护细胞.当镉浓度较低时,细胞自身抗氧化酶活性增大清除活性氧,当超过一定范围后,Cd2+可置换SOD中的Zn2+,改变SOD的构象,使细胞抗氧化酶系统受损严重,从而导致SOD 活力降低,所以Cd2+是SOD 的抑制剂[20].本实验中发现当氯化镉浓度为0~20 μmol/L 时,二倍体和三倍体细胞系的酶活性随染毒浓度的增加而升高,20 μmol/L 氯化镉浓度组SOD活性最高,以后逐渐降低,与孙淑红等[21]研究结果相似.
谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px 广泛存在于生物体内,能特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)与H2O2反应,是有机体分解过氧化氢的关键酶,可起到保护细胞膜的作用.实验结果显示,2 种细胞系在低浓度镉处理时,GSH-Px 活性略有升高,可能是SOD作用时可产生大量的过氧化氢,因此GSH-Px 活力升高,而GSH-PX的结构中含有硒,高浓度Cd2 +与硒形成复合物,破坏其活性部位,使GSH-PX活力降低.
GST是生物体内重要的代谢酶,存在于各种组织细胞中,具有消除自由基和解毒的双重功能[22],催化谷胱甘肽与可溶性脂质物结合,能防止脂质的过氧化.生物体的GST对污染物胁迫十分敏感,其活性变化可以反映污染物胁迫下的氧化应激反应[23].较多的研究结果是低浓度的污染物引起GST活性升高,而高浓度下GST活性降低[22],也有报道GST活性随染毒浓度的升高而降低[24].本研究中发现2 种细胞系中GST活力均随镉浓度的增加而降低,其原因可能与暴露时间、污染物类型及浓度剂量有关.
4.3 氯化镉引起细胞微核率的改变
近年来,泥鳅红细胞微核率的变化已作为监测水环境污染的一个重要指标[25-26].微核是染色体断裂的片段或有丝分裂后期滞留的染色单体,类似细胞核,但体积较小[26].Cd2+在细胞中破坏染色体,使其断裂,丢失,从而形成微核.本实验结果表明在较低浓度时微核率与镉浓度呈正相关,而后随着浓度升高,微核率反而降低,其原因可能是由于镉浓度过高时,抑制细胞分裂或使细胞核完全裂解,从而微核率降低.
4.4 氯化镉对MT基因表达的影响
金属硫蛋白(MT)是一类具有结合金属离子的蛋白质[27],可在转录水平上被重金属诱导大量表达,螯合过量的重金属离子,降低重金属对细胞的毒害作用,被认为是指示水污染的标志生物.本实验中发现泥鳅鳍细胞系MT在无氯化镉刺激时表达量很低,与王磊[18]所做的泥鳅MT基因在鳍组织表达结果相符；Cheuk等[28]曾发现,镉可诱导斑马鱼MT表达量升高,本实验中将细胞系暴露于氯化镉后,MT会大量表达,两者结果一致；并且2 种细胞均表现出先升高后降低的变化规律,可能是当镉浓度超过一定量时,细胞受损严重,各项机能显著降低,导致金属硫蛋白表达量下降.
4.5 二个细胞系间的比较
从半致死浓度来看,二倍体细胞系(24.0 &plun;0.7 μmol/L)低于三倍体(27.3&plun;1.3μmol/L),说明二倍体细胞系对镉更为敏感.而酶学和微核率的变化规律均为DIMF<TRMF.三倍体细胞比二倍体细胞大,细胞中各种物质相对较多[2],利于酶的生成,以抵抗外界不良环境,从而显示更高的抗耐性,因此酶活力略高于二倍体.三倍体细胞核比二倍体细胞核大,染色体数目增多,从而细胞核受到损伤的几率也相应增加,因此三倍体细胞系微核率大于二倍体细胞系.2 种细胞间MT的表达量未出现显著性差异,细胞中MT的表达是一个十分复杂的过程,其具体的表达方式还有待进一步的研究.
细胞论文参考资料：
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