原创《CCNG2基因过表达对甲状腺癌裸鼠移植瘤实验》
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梁会杰华北理工大学附属唐山市工人医院内分泌科063000
刘阁玲唐山市工人医院内分泌科063000
【摘 要】目的利用人K1甲状腺癌移植型裸鼠模型,探讨细胞周期蛋白G2（cyclinG2）的体内抑制肿瘤效应.方法将18只4周龄SPF级BALB/C雌性裸鼠编号,随机数字表法分为空白对照组、阴性转染对照组和CCNG2基因转染组,每组6只.常规扩大培养三种细胞,将生长状态良好的细胞消化后重悬于无血清培养基中,0.2ml/只（终浓度为5×107）于裸鼠右侧腋窝皮下按组别接种建立甲状腺癌动物模型,同时游标卡尺测量瘤体的长轴、短轴计算移植瘤体积,绘制生长曲线.30天后断颈处死所有组别的裸鼠,摘取瘤组织,免疫组织化学检测CCNG2蛋白的表达.结果所有组别裸鼠全部成瘤,成瘤率100%（18/18）.CCNG2基因转染组细胞组裸鼠成瘤时间延迟、瘤组织体积及生长速度缓慢,平均体积明显小于空白对照组和阴性转染对照组（F等于54.983,P＜0.001）,体积抑瘤率分为67.07%、62.32%.免疫组织化学检测结果示：LV-CCNG2转染组染色阳性指数分别为9.79&plun;0.658,与空白对照组和阴性转染对照组染色指数4.659&plun;0.371和4.719&plun;0.367相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）.结论慢病毒介导CCNG2过表达于人K1甲状腺癌细胞在裸鼠体内的生长受到了明显的抑制.
【关键词】细胞周期蛋白G2（CCNG2）；甲状腺癌；K1细胞；慢病毒；裸鼠
甲状腺癌（Thyroidcarcinoma,TC）是一种比较常见的恶性肿瘤,发病率在过去几十年中不断增加.尽管通过手术和放射性碘标准治疗后,能够拥有良好的预后反应和长期生存率.但是患者出现复发或放射性碘难治性疾病时只有15%～20%的10年生存率.因此,针对甲状腺癌的分子靶向治疗成为医疗领域迫切需要解决的问题.人类细胞周期蛋白G2（cyclinG2）是新发现的周期蛋白,参加调控肿瘤细胞增殖、凋亡和癌变与肿瘤发生发展及预后转归密切相关.研究显示,在众多的人类癌症的逐步进展模型中CCNG2的表达著降低,如口腔癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[[3-4]、胃癌[5]、食管癌[6],并且其表达与更高级别的癌症进展呈现负相关关系.但在甲状腺状癌中的作用报道较少.研究中我们通过慢病毒介导CCNG2基因过表达建立裸鼠移植瘤模型,观察对裸鼠移植瘤抑制作用；免疫组织化学方法检测CCNG2蛋白在甲状腺状癌中的表达情况,为甲状腺状癌的临床诊断及治疗提供理论依据.
1材料与方法
1.1细胞株及主要实验试剂
甲状腺状癌K1细胞株购自欧洲细胞培养中心(CAMR,Salisbury,UK).兔抗人CCNG2抗体够自于英国EterLife公司,免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司,CCNG2过表达慢病毒购自上海汉恒生物技术有限公司（HanbioCO.LTD）.
1.2实验动物
3～4周龄SPF级BALB/C雌性裸鼠,体重15～18g,16只,购自于北京辉奥生物技术有限公司(合格证编号:SYXK（冀）2015-0038),饲养于华北理工大学实验动物中心.
1.3实验方法及步骤
1.3.1慢病毒转染K1细胞LV-CCNG2过表达慢病毒以感染复数MOI等于50时感染K1细胞,加入浓度为5mg/ml的感染增强剂Polybrene；感染96个小时后,加入浓度为4μg/ml嘌呤霉素（Puromycin）筛选稳定表达细胞株,并扩大培养.
1.3.2裸鼠皮下成瘤实验将生长状态良好的三种细胞消化后重悬于无血清培养基中,0.2ml/只（终浓度为5×107）于裸鼠右侧腋窝皮下按组别接种建立甲状腺癌异种移植瘤模型,同时游标卡尺测量瘤体的长轴、短轴计算移植瘤体积,绘制生长曲线.
1.3.3免疫组织化学实验断颈处死裸鼠,摘取瘤组织,常规石蜡包埋,组织标本切成4μm厚的切片.
切片经二甲苯脱蜡,置于梯度乙醇中浸泡脱水,加入浓度为3%H2O2的溶液浸泡切片,以消除内源性过氧化物酶活性,在0.01mmol/L柠檬酸缓冲液中高压锅加热使其温度保持在130℃左抗原修复.入湿盒加10%正常封闭山羊血清封闭,37℃孵育20min.加入CCNG2稀释后的抗体（稀释度为1:200）,4℃湿盒过夜.第二天向组织切片上滴加Ⅱ抗,湿盒内37℃静置30min,之后滴加DAB显色剂显色,苏木精伊红复染2min,常规盐酸酒精脱水.最后透明、封片、镜检.结果判定：依据参考文献建立CCNG2、蛋白表达阳性的判定标准,CCNG2阳性表达主要为胞质染成浅、棕或黄褐色.在高倍镜下（400×）随机选取10个视野,计数1000个细胞,评定标准以细胞阳性百分率（≤5%等于0分,＞5%～25%等于1分,＞25%～50%等于2分,＞50%等于3分）及细胞染色强度（无染色等于0分,浅等于1分,黄褐色色等于2分,棕等于3分）得分之和进行判定.两项分数相加后评判:0分为阴性,1～6分为阳性.以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照.
1.4统计学分析
利用Excel2003软件将全部实验数据进行统计建库,利用SPSS17.0统计学软件对全部实验数据进行统计学分析,结果以均数&plun;标准差（x&plun;s）表示,多组间及同一时间点多组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA).采用检验水准α＝0.05,P＜0.05被认为差异具有统计学意义.
2结果
2.1慢病毒转染K1细胞的效率在慢病毒转染预实验中,设置MOI等于10、30、50、80,结果证实MOI等于50,转染效率最高,大于90%（见图1）.
2.2移植瘤生长曲线及体积抑瘤率接种三组不同的肿瘤细胞30天后,观察发现18只裸鼠全部成瘤,成瘤率100%（18/18）.在三组不同细胞接种裸鼠成瘤后连续观察发现,CCNG2基因转染组裸鼠成瘤时间延迟、瘤组织体积及生长速度缓慢,实验结束时平均肿瘤体积为543.42&plun;222.91mm3,明显小于空白组和阴性转染对照组,与空白组和阴性转染对照组比较,LV-CCNG2转染组体积抑瘤率分别为67.07%、62.32%差异具有统计学意义（F等于54.983,P＜0.05）.空白组及阴性转染对照组相比较,移植瘤的生长趋势均无明显统计学差异（P＞0.05）.（见表1、图2、图3）
2.3免疫组织化学结果CCNG2蛋白阳性表达主要为胞质染成浅、棕或黄褐色：LVCCNG2转染组移植瘤（C）染色阳性指数为9.79&plun;0.658,其与K1细胞组和阴性转染对照组比较,差异具有统计学意义（P＜0.001）；K1细胞组移植瘤（A）染色阳性指数为4.659&plun;0.371,阴性转染对照组移植瘤（B）染色染色阳性指数为4.719&plun;0.367,两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）.（见图4）
甲状腺癌（Thyroidcarcinoma,TC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤,约占全身恶性肿瘤的1%～5%,并以每年6.2%的速度在全球范围内持续快速增长.近年来,我国流行病学研究发现,国内甲状腺癌发生率明显升高,其增长速度是过去10年的2倍左右.因此,针对甲状腺癌的分子靶向治疗成为医疗领域迫切需要解决的问题.CCNG2基因最初发现于1996年,其编码的蛋白质与CCNG1同属于细胞周期蛋白家庭.研究报道显示,CCNG2是一个已知的肿瘤抑制基因,调控肿瘤细胞增殖、凋亡与瘤肿生长过程及预后转归息息相关.研究表明,CCNG2基因是多条抑制肿瘤发展信号通路的中间分子,一些肿瘤抑制基因通过促进CCNG2的表达防止细胞的过度增值.Mourgues[7]等发现在慢性粒细胞白血病的进展到急性阶段的过程中,BMI1与CCNG2呈负相关关系,因此推测沉默CCNG2介导的肿瘤抑制自噬应答可以诱导BMI1促进慢性粒细胞白血病的急性期转变.Salem[8]等研究发现CCNG2通过与β-catenin在粘附连接处形成复合物,将其锚定在膜上并且抑制其他下游靶基因的激活网络,从而抑制了Wnt/βcatenin信号通路中E-cadherin的表达,从而达到抑制卵巢癌细胞增殖.
本实验研究通过建立裸鼠移植瘤模型,从体内试验角度探讨它在甲状腺状癌中的情况.结果显示,LV-CCNG2基因转染组移植瘤生长速度、移植瘤体积明显低于空白对照组和阴性转染对照组,移植瘤出现明显的增殖移植.免疫组织化学技术检测同时显示,CCNG2蛋白在转染组表达明显升高,转染组瘤组织出现明显的抑制,这表明CCNG2蛋白过表达能够抑制甲状腺癌的发生发展.
综上所述,转染CCNG2的人K1甲状腺癌细胞对治疗裸小鼠乳腺癌有显著的抑制作用.为今后以CCNG2为中心的靶向治疗提供了新方向.
参考文献
[1]BernaudoS,SalemM,QiX,etal.CyclinG2inhibitsepithelial-to-mesenchymaltransitionbydisruptingWnt/β-cateninsignaling[J].Oncogene,2016,10(4):1038-1045.
[2]KimuraSH,NojimaH,etal.CyclinG1associateswithmdm2andregulatesaccumulationanddegr-adationofp5rotein[J].GenesCells,2002,7(8):869-880.
[3]FuGandPengC.NodalenhancestheactivityofFoxO3aanditssynergisticinteractionwithSmadstoregulatecyclinG2transcriptioninovariancancercells[J].Oncogene,2011,30(37):3953-3966.[4]MontagnerM,EnzoE,ForcatoM,etal
.SHARP1suppressesbreastcancermetastasisbypromotingdegradationofhypoxia-induciblefactors[J].Nature,2012,487(7407):380-384.
[5]AhmedS,Al-SaighS,MatthewsJ.FOXA1isessentialforarylhydrocarbonreceptordependentregulationofcyclinG2[J].MolCancerRes,2012,10(5):636-648.
[6]SunGG,HuWN,CuiDW,ZhangJ.DecreasedexpressionofCCNG2issignificantlylinkedtothemalignanttranormationofgastriccarcinoma[J].TumourBiol,2014,35(3):2631-2639.
[7]MourguesL,ImbertV,NeboutM,etal.TheBMI1polycombproteinrepressescyclinG2-inducedautophagytosupportproliferationinchronicmyeloidleukemiacells[J].Leukemia,2015,29(10):1993-2002.
[8]BernaudoS,SalemM,QiX,etal.CyclinG2inhibitsepithelial-to-mesenchymaltransitionbydisruptingWnt/β-cateninsignaling[J].Oncogene,2016,10(4)1038-1045.
实验研究论文参考资料：
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