原创《高效液相色谱法测定葡萄酒中白藜芦醇含量》
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摘 要：目的：分析高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄酒中白藜芦醇含量的方法.方法：采用HPLC 法测定葡萄酒中白藜芦醇含量,色谱柱,C18 柱；流动相,乙腈水；波长,306 nm.结果：葡萄酒中白藜芦醇线性范围0.227 ～ 45.003 μg,检测限、定量限分别为0.074 7、0.228 μg/mL,平均回收率为97.10%,RSD 为2.25%；精密度试验RSD 均＜ 2.0%.结论：高效液相色谱法可作为葡萄酒中白藜芦醇含量的测定方法,其操作简单、准确度高,可在临床检验中推广使用.
关键词：高效液相色谱；葡萄酒；白藜芦醇；含量测定
中图分类号：TS262.6；O657.72
我国造酒历史悠久,葡萄酒作为深受人民群众喜爱的酒精饮料之一,其酿造多是通过将新鲜葡萄（或葡萄汁）经发酵制成.研究指出,适度饮酒对机体具有一定的保健效果,这是因为葡萄酒中富含白藜芦醇、黄酮类、多酚类等物质,其中白藜芦醇具有保护心血管、抑制肿瘤、抗氧化、消除自由基、预防糖尿病、预防心肌病等功效[1].但目前不同葡萄酒品种中白藜芦醇含量的测定方法仍无完全统一,高效液相色谱法（HPLC）是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析[2].为此,本文就高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄酒中白藜芦醇含量进行分析和研究.
1 仪器与试剂
①仪器：美国Agilent 1100 高效液相色谱仪,二极管阵列DAD 检测器、上海光谱SP765P 紫外可见分光光度计,四元及真空脱气泵、赛多利斯BSA224S 电子分析天平、自动进样器、Bolong 超清清洗机、一次性滤器（0.45 μm）、滤膜、PHS-25pH 计等.②试剂与标准品：标准对照品白藜芦醇（纯度98%）由中国药品生物制品检定所提供；葡萄酒：宁夏西夏王葡萄酒业有限公司市售的2014 年份西夏王干红（赤霞珠）、西夏王干白（贵人香及霞多丽）,乙腈、甲醇为色谱纯,乙醇为国产分析纯,超纯水等,均为天津科密欧化学试剂有限公司产品.
2 方法与结果
2.1 制备标准品及供试品溶液
精密量取标准对照品白藜芦醇10 mg,将其置于10 mL 甲醇中充分溶解制成1 mg/mL 乙醇溶液（储备液）,精密量取适量置于甲醇中溶解并稀释制成1 mg/mL 的标准品溶液,置于冰箱低温（4 ℃）保存待用,HPLC 分析前,采用一次性有机滤器滤过处理,采用超声除去气泡,时间30 min.另取适量不同品牌干红及干白葡萄酒经滤膜（0.45 μm）过滤待用.
2.2 色谱条件
色谱柱,Agilent 1100-C18 柱（4.6 mm×250 mm,10 μm）；流动相,乙腈- 水（体积比为70 ∶ 30）；柱温,30 ℃；检测波长,306 nm；流速,1.0 mL/min；进样量,10 μL.色谱图如图1 所示.
2.3 线性关系
分别精密吸取不同质量浓度的储备液注入液相色谱仪内,于上述色谱条件下分析、测定峰面积.其中纵坐标、横坐标分别为峰面积、对照品溶液含量,分析后得到回归方程[3]：Y（葡萄酒白藜芦醇峰面积）等于19 970.67X-1 182.13（X 为葡萄酒白藜芦醇含量）,线性相关系数r等于0.999 8.葡萄酒中白藜芦醇在0.227 ～ 45.003 μg 范围内峰面积与各自含量保持着良好线性关系,其中分别利用3 倍、10 倍信噪比进行检测,结果检测限、定量限分别为0.074 7、0.228 μg/mL.
2.4 稳定性及加样回收率试验
取标准品溶液7.5μg/mL,参照2.1 方法分别于0、1、3、5、8、12 h 各进样10 μL 进行含量测量,共测量6 次,分别记录峰面积[4],结果显示白藜芦醇峰面积的相对标准偏差（RSD）值为2.25%,其在12 h 内的稳定性均较好.另取标准品溶液5 份,分别加入7.5 μg/mL白藜芦醇标准品,参照2.1 方法每次进样10 μL,结果显示葡萄酒白藜芦醇的平均加样回收率为97.10%,准确度较高.
2.5 精密度试验
精密吸取标准品溶液1.875、7.5、45 μg/mL 参照2.1 方法于同等色谱条件下重复进行8 次以上试验,记录各次峰面积.通过分析,白藜芦醇峰面积RSD 均＜ 2.0%,精密度良好.
3 讨论
3.1 溶剂于检测波长选择
将白藜芦醇分别溶于水、、乙醇及乙腈水中,经滤膜滤过后采用进样器取配好适量溶液注入进样阀,定量10 μL,采用HPLC 法对葡萄酒中的白藜芦醇进行检测,结果显示标准对照品峰面积与溶剂呈正相关性.经分光光度计扫描分析显示,白藜芦醇在检测波长为306 nm 时的吸收峰较大,故本文于HPLC 法下选用306 nm 作为检测波长.
3.2 流动相选择
本文采用不同比例的乙腈水溶液进行预实验,结果提示二者按照体积比为70 ∶ 30 混合、提取、脱脂后经液相色谱仪下检测出的干扰成分最少,脱脂效果最佳.70 ∶ 30 的乙腈水进行于流速1 mL/min,HPLC法下检测白藜芦醇,结果显示标准品峰面积与实验流动相的呈较好的正相关性,即其峰面积越大,流动相越好.其中在Agilent 1100-C18 柱（4.6 mm×250 mm,10 μm）色谱柱,检测波长306 nm,流动相乙腈- 水,柱温30 ℃,,流速1.0 mL/min,进样量10 μL.
4 结语
白藜芦醇是存在于葡萄皮中的一种非类黄酮天然活性物质,是葡萄在应激霉菌的感染和作用下所产生的具有降血脂、抗氧化以及降低血液黏稠度的保健效果.白藜芦醇微溶于水,但易溶于乙醇,葡萄酒的制备过程主要有干红和干白两种工艺,其中干红葡萄酒是指将葡萄进行带皮发酵,因此在发酵过程中,白藜芦醇能够通过乙醇的浸提而从葡萄皮中转移到葡萄醪中；干白葡萄酒的制备是利用纯汁进行发酵,这使得富含白藜芦醇的葡萄皮与葡萄汁被早早分离,故市场上将白藜芦醇质量浓度的测定结果作为葡萄酒品质衡量和评价的重要指标之一.
目前,对于白藜芦醇的检测方法多种多样,如毛细管电泳法、薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法及色质联用等.但通过本研究的实验设计以及实验结果,高效液相色谱法不仅操作便捷,而且耗时较短,结果准确,因此适用于葡萄酒中白藜芦醇含量的测定.
葡萄酒论文参考资料：
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