原创《葡萄幼叶环状RNA（CircRNA）的鉴定和分析》
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摘 要：本研究以‘赤霞珠’葡萄幼叶为试材,构建环状RNA测序文库并鉴定了1172个环状RNA.结果表明,这些环状RNA的来源基因涉及多种功能,包括抗逆、抗病、发育等,并且这些环状RNA中有74个可以结合73种葡萄miRNA,而大部分不能结合miRNA.这73种可以结合环状RNA的葡萄miRNA共靶向710个靶基因.很多涉及的miRNA都对应了个10以上靶基因.比较了靶基因和环状RNA来源基因,发现有很多功能类似,但是也有很多不同的功能.GO分析显示二者最富集的条目都是细胞、细胞部分、细胞器、催化活性及绑定.但是二者被注释的条目种类差别很大.说明葡萄环状RNA来源于不同种类的基因,且可能调控多种基因.
关键词：葡萄；幼叶；环状RNA；miRNA；靶基因
中图分类号：S663.1；Q75 文献标志码：A
DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2018.06.006
Identification and analysis of circRNAs in grape young lees
CHEN Yingchun, WU Xinying, JIANG Xilong, ZHANG Qianqian, LI Yi, MU Qian, YANG Liying, WANG Yongmei,ZHANG Jiakui*, WANG Pengfei*
（Shandong Academy of Grape/Key Laboratory of Urban Agriculture in East China, Ministry of Agriculture, Jinan 250100, China）
Abstract: In this study, circRNA-seq library of grape cv. ´Cabernet Sauvignon´ young lees was constructed and1172 circRNAs in grape were identified. Result showed that the derived-genes of grape circRNA were involved inmany function including abiotic and biotic stresses tolerance, and development. 74 grape circRNAs could bind to 73kinds of miRNAs and most of circRNA could not bind to miRNAs. Many grape circRNAs could regulate more thanten target genes of grape miRNAs. It found that the functions of many derived-genes of grape circRNA were similarwith the function of some target genes of grape miRNAs. GO analysis showed the enriched terms were cell, cellpart, organelle, catalytic activity and binding. However derived-genes of grape contained some specific terms andtarget genes of grape miRNAs also contained some specific terms. Above result indicated that the grape circRNAderived from different genes and might regulate many different ge nes.
Key words: grape; young leaf; circRNA; miRNA; target gene
在生物细胞内,除了含有信使RNA（messengerRNA,mRNA）之外,还含有各种类型的非编码RNA.例如microRNA（miRNA）,小干扰RNA（all interfering RNA,siRNA）,反式作用RNA（trans-acting siRNA,tasiRNA）以及长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）等.而环状RNA（circRNAs）则是一类最新发现的独特的非编码RNA[1-3].而在其起初发现后的十几年内,环状RNA曾被认为是一种RNA剪切拼接的错误[4].目前,随着高通量深度测序技术的飞速发展,大量的环状RNA在动物中被发现.研究显示环状RNA在动物细胞内稳定并高水平表达,而这些被发现的环状RNA也被证实在很多生物学过程中发挥重要作用[1,2,6-8].
环状RNA可以起源于外显子（此类为外显子起源环状RNA）,内含子（此类为内含子环状RNA）以及基因间区[9-11].也可以是部分源自内含子而部分源自外显子（此类为外显子-内含子起源RNA,exon-introncircRNA,EIciRNA）[12-15],甚至可以源自转运RNA（tRNA）的内含子（此类为tricRNA）[16].环状RNA是由于RNA头与尾的反向剪切而形成的.与线性RNA不同,环状RNA不含有5´端的帽子结构和3´端的尾部,其形态是上游RN段和下游RN段相连形成封闭的环状[10].因此,环状RNA不会被RNA酶R降解[11].然而大部分的环状RNA被发现是源自蛋白编码基因的外显子[17].研究表明序列的互补及外显子跳跃是环状RNA形成的原因[18-22].而有的研究显示,环状RNA也可以通过含外显子的套索前体产生[23].此外,RNA绑定蛋白也涉及环状RNA的形成过程.例如MBNL1、ADAR1及Quaking也可以在环状RNA合成中起到重要作用[24-26].而环状RNA一旦被合成,由于其缺少起始子和终止子,因而不能编码蛋白序列[24,26].
环状RNA目前被发现的功能主要是作为miRNA海绵.例如已经发现的ciRS-7（也被称作CDR1as）,就被发现包含超过70个保守的miR7结合位点[27].由于ciRS-7对miR7的结合,使得miR-7的活性大大降低,从而增加miR-7靶基因的表达水平.而环状NRAciRS-7一旦被降解,miR7则会被释放[28].Sry则是另一种被证实为miRNA海绵的睾丸特异表达的环状RNA[29].该环状RNA含有16个miR138的绑定位点.这些发现增加了对miRNA调控网络的理解,并增加了我们对竞争性内源RNA（ceRNA）网络机制的认识[30].环状RNA也可以作为一种蛋白海绵.例如果蝇和人中的环状RNA circMbl.这种环状RNA上存在许多的muscle blind蛋白结合位点[26].环状RNA circMbl可以清除多余的muscle blind蛋白,从而调控该蛋白的表达水平[26].有的环状RNA（ecircRNA）可作为“mRNA陷阱”,隔离翻译起始站点,从而导致线性mRNA无法翻译.例如,小鼠formin（FMN）基因可产生作为mRNA陷阱的ecircRNA[31].此外,环状RNA可以通过与Pol II的互作从而正调控Pol II转录[14].最近研究还显示,EIciRNAs可以通过与U1 snRNA的互作微调控父母本基因的表达[16].这一发现不仅揭示了环状RNA在转录调控中的作用,但也揭示了特异EIciRNA和U1snRNA相互作用的调控机制.总的来说,环状RNA与转录机制相互作用细胞中基因表达调控机制提供了新的观点.
在哺乳动物中,环状RNA在突触中高表达,并且在神经元分化过程中差异表达[26].环状RNA在许多肿瘤中也有广泛的表达,其表达水平与人类肿瘤的临床特征密切相关.因此,环状RNA在癌症中将可能被作为一种疾病的生物标志物[32].而与对动物环状RNA的研究相比,对植物中环状RNA的研究相对较少[33].在水稻中,一些环状RNA在磷充足和磷饥饿的条件下差异表达,显示了环状RNA可能在对磷饥饿的应激反应中起到作用[34].这些结果表明,环状RNA也在植物中大量存在,并且可能在非生物胁迫响应中起到重要的作用.
葡萄是一种重要的果树.而目前对葡萄环状RNA的研究尚未开展.本研究将利用高通量测序及计算机预测的方法鉴定葡萄叶中环状RNA的数量、种类以及在叶中表达水平.并探索其来源的基因及其功能.并初步预测这些葡萄环状RNA可能靶向的miRNA.本研究将丰富对葡萄中环状RNA的了解,并为葡萄miRNA调控网络的研究打下基础.
1 材料和方法
1.1 试验材料
采集酿酒葡萄品种‘赤霞珠’一年生自根苗的幼叶,用于总RNA的提取.
1.2 方法
1.2.1 RNA提取
利用TRIZOL试剂盒（购自Invitrogen公司, USA）提取幼叶的总RNA,操作步骤按照试剂盒说明书.
1.2.2 环状RNA文库构建及高通量测序
用Ribo-ZeroTM Magnetic kit植物叶片专用试剂盒去除总RNA中rRNA.委托华大基因公司构建环状RNA测序文库并进行高通量测序,测序平台为Illumina Hiseq2000系统.
1.2.3 生物信息学法鉴定环状RNA
葡萄基因组序列被下载自葡萄基因组网站（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php）.得到的cleanread用Bowtie2软件比对到葡萄基因组上,去除不能比对上的read,留下能比对到基因组上的read进行下一步分析.利用CIRI和find circ软件分析比对到基因组上的read,找到接合位点测序读段对.CIRI通过两次扫描比对生成的SAM（Sequence Alignment/Map）文件来检测circRNA.最后,经过一系列过滤得到候选的环状RNA.其本质就是找到正确的接合位点测序读段对,而依据接合位点测序读段对判断出这是环状RNA的一部分,从而鉴定发现环状RNA.
1.2.4 环状RNA表达量的分析
根据比对环状RNA的接合位点测序读段对数来计算环状RNA的表达量,由于使用了CIRI、find circ这两个软件来预测,取两者最终的接合位点测序读段对数结果的平均值.本文采用RPB作为环状RNA的均一化表达量数值.RPB＝比对上基因组的所有reads标准化到十亿后跨过back-spliced位点的junction reads数目.
1.2.5 Nr和GO注释与分类,KEGG注释及KEGG pathway通路分析
利用blastP软件在NCBI Nr数据库检索涉及基因编码蛋白的功能注释.利用在线软件Blast2Go（https://www.blast2go.com/）对该研究涉及基因编码的蛋白进行分析,搜索其对应的GO功能注释.然后利用在线软件BGI WEGO（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）对这些注释过的基因进行分类.利用KEGG在线数据库（http://www.kegg.jp/kegg/ko.html）中的线软件BlastKOALA（http://www.kegg.jp/blastkoala/）对涉及的基因进行比对分析,搜索其对应的KEGG功能注释及KO号.利用这些基因KO号在KO数据库（https://www.kegg.jp/kegg/ko.html）中进行搜索,从而比对到这些基因所处的KEGG 通路.
1.2.6 靶向环状RNA的miRNA初步预测及miRNA靶基因的预测
将利用psRobot（http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/）和psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）在线软件预测miRNA的靶基因以及与miRNA可以结合的环状RNA.葡萄miRNA序列下载自miRbase（http://www.mirbase.org/）.
2 结果与分析
2.1 环状RNA的鉴定及其表达分析
综合两个软件的鉴定结果,在葡萄幼叶鉴定出1172个环状RNA.根据其在基因组上的起始、终止位置定位,将其分为基因来源的环状RNA和基因间区来源的环状RNA.其中基因来源的环状RNA有1147个,这些环状RNA来源于1478个蛋白编码基因.基因间区来源的环状RNA有25个.这些环状RNA在基因组上的位置显示,其在葡萄的各个染色体上均有分布.暂时以这些葡萄环状RNA的染色体号,及在染色体上的起始、终止位置命名,作为其ID.
通过分析这些葡萄环状RNA表达量认为, 表达量最高的环状RNA为chr12:3260512|3271102,其表达量（ R P B ） 为5 0 3 1 3 ； 表达量第二高的为c h r 6 : 5 6 2 2 4 1 3 | 5 6 2 9 7 5 6 ； 第三高的为chr4:3368165|3380481.在这些环状RNA中,表达量最低的环状RNA表达量（RPB）为81.
2.2 环状RNA来源基因的Nr,GO和KEGG注释分析
我们分析了这些葡萄环状RNA来源基因的功能.Nr注释结果显示,这些环状RNA来源基因的功能注释为942种.这些基因中, 有的具有抗病相关功能,例如抗TMV蛋白N,抗病基因座类受体蛋白激酶,抗病蛋白（VIT_201s0011g01110,CircRNAchr1:968621|979574）.有的与发育相关,例如类细胞分裂周期蛋白5.有的与激素信号相关,例如AFR.有的与植物抗逆相关,例如hsp70.有的与表观修饰相关,例如DNA（胞嘧啶-5）转移酶1.一些环状RNA来源于转录因子家族,例如NAC转录因子家族,GATA转录因子家族.此外,这些环状RNA的来源基因还包括查尔酮合成酶、鲨烯合酶、细胞色素 P450CYP72A219、LEAF RUST 10、NAD(P)H脱氢酶、质磷酸磷酸酶2同种型X2、肌动蛋白相关蛋白3同种型X1.
GO注释结果显示,这些环状RNA来源基因可以被分为3个大类：生物学过程、分子功能以及细胞组分.这些基因被注释为细胞组分的有358个,被注释为分子功能的为431个,而被注释为生物学过程的有341个.这些基因在细胞组分大类下又被分为14个条目.其中大多数基因被注释为细胞、细胞部分以及细胞器.这些基因在分子功能大类下又可被分为8个条目.其中大多数基因被注释为催化活性,绑定及刺激反应.这些基因在生物学过程大类下又可被分为16个条目,其中大多数基因被注释为代谢过程、细胞过程及定位（图1）.
KEGG注释结果显示,这些环状RNA来源基因可以被比对到276个KEGG通路上,涉及的生物学过程包括：代谢途径、次级代谢途径、碳代谢、RNA降解途径、剪切体及核糖体等生物学过程（表1）.
2.3 与环状RNA结合miRNA的鉴定与分析
根据生物信息学预测, 共鉴定出可以靶向这些环状RNA的miRNA73个,包括vvi-miR393a、vvimiR393b、vvi-miR396a、vvi-miR535b、vvi-miR845c、vvi-miR156a等.涉及最大的miRNA家族为miR156、miR166家族.在这些环状RNA中,能被miRNA靶向的仅有74个.我们又利用生物信息学方法预测了这73个miRNA的靶基因,共有710个靶基因被鉴定.很多涉及的miRNA都对应了10以上靶基因,例如vvi-miR3630-,其靶基因包括13个,分别是VIT_208s0040g00990、VIT_207s0031g02270、VIT_207s0005g05420、VIT_204s0023g00310、VIT_202s0033g00870、VIT_202s0033g00850、VIT_202s0033g00840、VIT_202s0033g00800、VIT_202s0033g00790、VIT_202s0033g00700、VIT_202s0033g00670、VIT_202s0033g00660及VIT_216s0098g00970.v v i - m i R 3 6 3 0 - 3 p 靶向的环状RNA为C i r c R N A -chr2:15496105|15589650.该环状RNA的来源基因为VIT_202s0033g00850,也是vvi-miR3630-靶基因之一.这些靶基因涉及许多生物学功能,有的具有抗逆相关功能,例如HSP90.1,HSP83及LEA2.有的具有抗病相关功能,例如类RPP13蛋白1及抗TMV resistance类N-蛋白.有的与激素信号相关,例如类生长素蛋白、AFR18、AFR23、类生长四转运蛋白、生长素诱导单笔及乙烯不敏感蛋白 2.有的与发育相关,例如细胞周期检查点控制蛋白、细胞分裂周期20.2、类APC复合物辅因子、细胞分裂蛋白FtsZ同系物1、生长调节因子1.很多靶基因为转录因子,例如类AP 2、TOE 3、ERF0 38、ERF0 84、类GATA 24-like、myb、NAC 25、bHLH77及GAMYB.此外,这些靶基因还包括类黄酮3´,5´-羟化酶2、SPL16、SPL6和SPL7,及跨膜蛋白45B.而SPL基因和未知功能的基因占据最多比例.
GO注释结果显示,这些靶基因也可以被分为3个大类：分别为其中被注释为细胞组分的有516个,被注释为分子功能的为559个,而被注释为生物学过程的有528个.在细胞组分大类下又可被分为16个条目,其中大多数靶基因被注释为细胞、细胞部分以及细胞器；在分子功能大类下又可被分为12个条目,其中大多数基因被注释为催化活性、绑定及生物调控；在生物学过程大类下又可被分为30个条目,其中大多数靶基因被注释为代谢过程、细胞过程及刺激反应,图2.
KEGG注释结果显示,这些靶基因可以被比对到184个KEGG通路上,涉及的生物学过程包括：代谢途径、次级代谢途径,植物激素信号转导途径,植物与病原菌互作途径,泛素介导的蛋白水解及碳代谢等生物学过程（表2）.
3 讨论与结论
在本研究中,共鉴定了1172个葡萄幼叶中的环状RNA.之前的研究显示,Ye等在水稻和拟南芥中鉴定出12037个和6012个环状RNA[34].Lu等报道了2354个水稻中的环状RNA[35].Wang等在小麦中分离出88个环状RNA[36].Zuo等在番茄中发现854个环状RNA,其中163个环状RNA显示出了对低温的响应[38].Zhao等在大豆中发现了5372个环状RNA[37].我们在葡萄中鉴定的环状RNA数目与番茄相似,比其他物种少.这可能是由于我们只选取了一个组织进行鉴定.
被鉴定环状RNA来源的基因涉及很多功能,包括抗逆、抗病、发育等.目前已知的环状RNA一个重要功能就是作为CeRNA机制的一部分,通过参与调控miRNA来调控miRNA靶基因的表达[28].因此分析这些环状RNA可能涉及的miRNA,发现这些环状RNA可以结合73种葡萄miRNA.这1172个环状RNA中有74个可以结合miRNA,大部分不能结合.说明可能很多环状RNA不涉及ceRNA机制.这些能结合miRNA的环状RNA证明在葡萄中也存在ceRNA机制,即“环状RNAmiRNA-靶基因”的三联单元.例如“CircRNAchr2:15496105|15589650-vvi-miR3630--靶基因”单元比较复杂,涉及的靶基因较多.
我们比较了靶基因和环状RNA来源基因,发现有很多功能类似,但是也有很多功能不同.GO分析显示二者最富集的条目都是细胞、细胞部分、细胞器、催化活性及绑定.但是二者被注释的条目种类差别很大.KEGG分析显示二者所包含成员被比对到的KEGG通路中种类也有所不同.例如只有环状RNA来源基因中有成员可以被定位到剪切体及核糖体通路,而只有miRNA靶基因中有成员可以被比对到植物激素信号转导通路,植物与病原菌互作通路及泛素介导的蛋白水解通路.
本结果显示,葡萄中有限的或较少的环状RNA可以通过调控miRNA来调控更多不同种类靶基因,从而发挥多种功能.而预测环状RNA结合miRNA方法,主要是检测本测序得到的接合位点的测序读段对序列上的miRNA结合位点.如果将来能够通过实验确定全部环状RNA的完整序列,则可能会发现更多的miRNA结合位点.
葡萄论文参考资料：
该文结束语:这是关于对不知道怎么写葡萄和CircRNA和环状论文范文课题研究的大学硕士、葡萄本科毕业论文葡萄论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料。
