原创《鸡源绿脓杆菌的分离鉴定与药敏试验》
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摘 要：将某鸡场送检的病死鸡作为研究对象,分析其细菌性疾病的主要病原菌,通过分离培养、生化实验、免疫荧光抗体染色、药敏试验以及PCR试验等步骤,分析病原菌的形态特征,了解其耐药性,并将其PCR测序结果与GenBank数据库中的基因序列进行对比,对比结果表明病原菌为绿脓杆菌.
关键词：鸡源；绿脓杆菌；药敏试验
绿脓杆菌又被称作铜绿假单细胞菌,能够导致多种动物的脏器出现脓肿,所以绿脓杆菌可以从伤口的脓液中分离获得.各年龄段的鸡都会受到绿脓杆菌的感染,导致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病,死亡率高达80%.
1实验材料
实验样品选取某鸡场送检的4只病死鸡,对其进行剖检,并在无菌环境下采集病死鸡的肝脏与肺脏；实验采用的试剂包括琼脂糖、DL2000DNAMarker、10×LoadingBuffer、肠杆菌科、JAMES液以及快速革兰氏染色液等；实验采用的培养基包括血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基等.
2实验方法
（1）细菌的分离培养.在病死鸡的肝脏和肺脏中分离出细菌,通过划线方法将其接种于麦康凯平板、营养琼脂平板以及血液琼脂平板上,分别将3个平板放置于37℃的条件下培养24小时.然后选取其中的典型菌落,分别设置为1-4号,在典型菌落纯培养的过程中进行革兰氏染色,在显微镜下观察细菌.
（2）细菌的生化实验.根据肠杆菌科相关鉴定试剂盒中带有的说明书,对细菌分离培养中的纯培养物进行生化实验.实验的仪器为ATB自动生化检定仪,明确鸡源细菌的种属.
（3）免疫荧光抗体染色.在载玻片中滴加1滴PBS,并在培养基中挑取单个菌落均匀涂布在载玻片的PBS上,在菌落自然干燥后使用甲醇进行15分钟干燥；再使用PBS冲洗5分钟,共冲洗3次；然后在载玻片上添加一抗,在37℃的条件下孵育30分钟,再使用PBS冲洗之后添加二抗,在37℃的条件下孵育30分钟；最后使用PBS冲洗后使用蒸馏水漂洗,干燥后放置于荧光显微镜下观察.能够产生蓝绿色荧光素以及蓝色绿脓素的细菌为绿脓杆菌.
（4）药敏试验.制作绿脓杆菌的肉汤培养物,根据Kirby-Barer氏法,在营养琼脂平板的表面均匀涂布培养物.使用无菌镊子将20种抗生素的药敏试纸粘贴于培养基表面（需要注意的是,药敏试纸需要等距粘贴）,然后将培养基放置于37℃的恒温培养箱中培养18~24小时.培养期间观察并记录试纸上的抑菌圈直径,按照NCCLS（2009）标准进行药敏试验结果分析.
（5）PCR试验.应用细菌纯培养物进行PCR试验,首先将其接种于普通LB液体培养基中,进行24小时培养,然后根据树脂型TM基因组DNA提取试剂盒中带有的说明书,进行分离菌株基因组DNA的提取,进一步鉴定绿脓杆菌.试验采用的上游引物序列为5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’,下游引物序列为5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’.最后根据基因组DNA进行PCR反应,并通过1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测,明确PCR产物的序列[1].
3实验结果
（1）细菌分离培养结果.分离培养后,营养琼脂平板上的菌落呈现出表面光滑、边缘参差的形态,整体呈绿色,具有一定的芳香气味；麦康凯平板上的菌落呈半透明形态,整体为圆形；血液琼脂平板上的菌落为不规则形状,呈灰色,带有溶血环.通过显微镜观察,1~4号分离菌均为革兰氏阴性小杆菌,初步判定细菌为绿脓杆菌.
（2）生化实验结果.1~4号分离菌的生化实验结果相同,都可以分解酯酶、尿素酶以及D-葡萄糖,可以将其鉴定为绿脓杆菌,符合率高达99.9%.
（3）抗体染色结果.1~4号分离菌染色后在显微镜下呈现的形态为两端钝圆,颜色为荧光绿色,属于短小杆菌,与绿脓杆菌的特征相符.
（4）药敏试验结果.1~4号分离菌的药敏试验结果相差无几,对大观霉素、庆大霉素以及头孢曲松等药品高度敏感,对强力霉素以及四环素中度敏感,对红霉素以及头孢噻吩等药品不敏感,具有一定的耐药性.
（5）PCR试验结果.根据PCR试验获得的序列,将其与GenBank中公布的16株参考菌株进行同源性比对,比对结果显示,2号分离菌的同源性在99.7%~100%之间,可以将其鉴定为绿脓杆菌.
4结论
综上所述,绿脓杆菌对于阿莫西林、头孢噻吩以及红霉素有较强的耐药性,对头孢曲松、阿米卡星以及庆大霉素等高度敏感,可以使用这类药品进行防治.
参考文献：
[1]秦绪伟,王蕾,刁有祥.蛋型绿脓杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].畜牧兽医科学(电子版),2017(02):1-2.
鉴定论文参考资料：
综上而言：该文是一篇关于对不知道怎么写绿脓杆菌和鸡源绿脓杆菌和分离鉴定论文范文课题研究的大学硕士、鉴定本科毕业论文鉴定论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料。
