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研究进展方面本科论文范文 跟微生物源脂肽进展方面论文怎么写

版权:原创标记原创 主题:研究进展范文 类别:专科论文 2024-03-17

《微生物源脂肽进展》

本文是研究进展毕业论文开题报告范文跟微生物源脂肽和研究进展和微生物相关论文范本。

摘 要:脂肽可以由多种微生物产生,能降低表面和界面处的张力,已经作为表面活性剂得到了广泛的应用.但是脂肽所具有的抗菌、抗肿瘤、溶血栓和杀虫等生物学活性还有待深入研究.为了使脂肽在更多领域发挥巨大的应用潜力,推进新型脂肽产品的研发进程,文章回顾了脂肽的菌种来源、结构类型、理化特性、生产状况、合成机制及提纯工艺,归纳了脂肽在石油开采、临床医学和生物防治领域的应用现状,分析了其在生产上所存在的产量较低、提取技术不成熟等问题,并对今后脂肽的研究方向进行了展望.

关键词:脂肽;生物活性;生产状况;合成机制;提取技术

中图分类号:939.92 文献标志码:A 论文编号:cjas17040021

0 引言

自从1968 年Arima 等在枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的代谢产物中首次发现了脂肽类生物表面活性剂(商品名为Surfactin)以来,人们对脂肽类物质的研究日益深入和广泛.脂肽类物质在天然情况下是一组混合物,通常由归属于相同家族或类别的各种大分子组成.其化学结构是由非极性的疏水基(饱和或不饱和脂肪酸)与极性的亲水基(氨基酸或肽、二糖或多糖、阴离子或阳离子)两部分构成,同一分子的两端分别由结构与性能截然相反的2 种分子基团构成,二者之间以化学键相连接,结构不对称,具有明显的极性,既亲水,又亲油.这种化学结构赋予了脂肽类物质强大的降低表面和界面张力的功能.因此,人们通常将脂肽类物质作为一种生物表面活性剂来使用[1].

近年来,人们发现微生物源脂肽不但是一种优良的天然表面活性剂,而且还具有抗菌、抗病毒、杀虫、和溶血栓等多种生物功能[2],这些功能使其在石油开采、临床医学、生物防治等领域的应用前景蔚为可观.目前大多数已报导的脂肽的产量还没有达到生产水平,难以商品化生产.而脂肽发酵过程中又往往会产生多种结构类似物,分离纯化难度高,这些问题是阻碍脂肽商品化的主要问题.另外,多数研究主要集中在脂肽化学结构的鉴定上,这些研究让人们充分认识到了脂肽的结构多样性和功能的多元化.因此,继续挖掘新型高效的脂肽类物质,使其充分发挥其多元化的功能,具有重要的科学意义和实际应用价值.因此,本研究对微生物源脂肽的最新研究进展进行了概述,以期为多尺度研发脂肽的功能及推进其实际应用进程提供科学依据.

1 脂肽的种类和菌株来源

目前发现细菌、蓝细菌、放线菌、真菌都能产生脂肽类物质.众所周知的表面活性素(Surfactin)家族、伊枯草素(Iturins)家族和芬枯草素(Fengycins,也译为芬荠素、丰源素)家族的三大类脂肽最初是在芽胞杆菌代谢物中分离到的[3],芽胞杆菌还能产生地衣霉素(Lichenyishin)、地衣素(Lichenysin)、制磷脂菌素(Plipastatin)、环状芽胞菌素(Circulocins)、八肽菌素(Octapeptins)、库斯塔克素(Kurstakins)、嘌呤霉素(Pumilacidin)、埃斯波素(Esperin)、短杆菌素(Brevibacillin)[4]等脂肽;假单胞菌属产生的脂肽也多种多样,已报导的有Viscosinamide、Amphisin、Tensin、Massetolides、Pholipeptin.其它已报道的微生物源脂肽有蓝细菌产生的Laxaphycin A和B、Antillatoxin,链霉菌产生的达托霉素(Daptomycin)、球霉素(Globomycin)、天冬霉素(Laspartomycin),镰刀菌产生的Fusaristatin A和B、恩镰孢菌素(Enniatin),念珠菌属产生的棘白菌素(Echinocandin)[5]等.新脂肽的不断发现使人们意识到,微生物产生的脂肽不但在结构和功能上具有多样性,而且来源广泛,资源丰富,值得深入挖掘.

微生物产生的脂肽种类与产量受其种属特征的影响很大,本实验室对枯草芽胞杆菌、侧孢短芽胞杆菌(Brevibacillus laterosporus)和链霉菌产脂肽的特性进行了研究,发现枯草芽胞杆菌和两株链霉菌产生脂肽的量相对较大且稳定,而侧孢短芽胞杆菌产脂肽的水平较低,且产生状况对环境条件变化非常敏感.

2 微生物源脂肽的特性

脂肽类物质具有乳化/脱乳、分散、发泡、减粘、增溶以及成孔能力,可以在许多领域中应用.据报道脂肽中的Surfactin还具有耐20%以上高盐和121℃高温[6]、可生物降解的特性[7],且毒性低(LD50为2500 ~5000 mg/kg)[8],比化学合成的乳化剂在安全性和与环境的和谐性方面更有优势,可以作为化学表面活性剂的替代品.微生物源脂肽的这些特性也为其向医药和农药领域的发展提供了很大的空间.

3 微生物源脂肽的生产状况

尽管能产生脂肽的微生物资源非常丰富,但是真正达到生产水平的并不多,主要有枯草芽胞杆菌生产的Surfactin、Iturin 和Fengycin[3];玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)生产的Daptomycin[5];地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)生产的Lichenyishin;短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) 生产的表面活性剂Pumilacidin、Esperin[9].

产量低一直是微生物源脂肽生产的主要瓶颈问题.脂肽类表面活性剂通常通过微生物在水混溶或不混溶底物上发酵来产生.营养底物、接种量、pH值、温度和曝气等条件均可影响脂肽的生产.因此,脂肽产量的提高可以通过优化发酵条件和选育过量生产的微生物突变体来实现.另外,菌种本身的生产能力也是不容忽视的问题,有些菌株产脂肽的水平对环境变化过于敏感,使其生产和应用受到了极大限制.

3.1 使用低成本原料

脂肽的生产成本主要取决于原材料的使用量和原材料的类型,据估计,在大多数生产中约30%~40%的生产成本为原材料[10].利用低成本的农业副产品作为底物来生产脂肽,可以显著降低生产成本[11].有文献表明可以使用木薯废水、植物来源的油、石油废物、淀粉物质、乳酸乳清和酿酒废物等各种廉价原料作为底物来生产脂肽[12].Makkar 等[13]发现向日葵油饼能显著提高伊枯草素A的生产量.Seghal 等[14]使用工农业固体废料或残渣来优化海洋放线菌金短杆菌(Brevibacterium aureum) MSA13 的生物表面活性剂的生产,使产量增加到原始条件的3 倍,而且还产生了新的脂肽,该脂肽具有十八烷酸甲酯的疏水部分和被预测为包括pro-leu-gly-gly四个氨基酸的短肽序列.

3.2 使用突变体和重组菌株

突变体无疑是实现提高脂肽产量的重要手段.闫冬等[15] 通过亚硝基胍诱变多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)JSa-9,使其产生的抗菌脂肽是原来的1.71 倍.李光等[16]采用利用常压室温等离子体(atmospheric pressure and room temperature plaa,ARTP)对枯草芽胞杆菌E7 进行快速诱变,获得的突变菌株90-5 所产生的Surfactin 的产量是原来的5 倍.笔者实验室依次采用紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍对侧孢短芽胞杆菌BL-21 进行诱变处理,使突变体产脂肽的量提高了1.9 倍.目前,高通量筛选(Highthroughput screening,HTS)技术已经应用于脂肽高产突变株的筛选,主要是利用氯化十六烷基吡啶-溴百里酚蓝(CPC-BTB)显色原理来检测脂肽的含量[17],利用96孔板来替代传统的摇瓶筛选,提高了筛选效率.

除了利用突变体提高产量外,基因重组技术已经在获得高产脂肽菌株方面取得了一定的效果.Leclere等[18] 利用来源于金葡萄球菌(Staphylococcusaureus)质粒pUB110 的复制基因repU 的组成型启动子替代枯草芽胞杆菌ATCC 6633 操纵子的天然启动子获得了重组菌株BBG100,使抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)的产量比野生型提高了15 倍,其产量提高的效率远远高于常规诱变.

4 脂肽的生物合成

脂肽的生物合成机制和基因调控系统已经被广泛分析.最初是Grangemard 等[19]研究并报道了枯草芽胞杆菌IAM1213 产生脂肽类生物表面活性剂的机制,继而人们研究了其它芽胞杆菌菌株合成脂肽的过程.发现与脂肽类物质化学结构的多样性相反,各种脂肽的生物合成机制基本上是保守的.通常情况下,脂肽由独立合成的肽和脂质部分的缩合产生.

脂肽的脂质部分的生物合成通过许多连续的模块来实现,其脂肪酸与肽部分的偶联、活化和连接,共需要五步[20].首先,Acyl Co A连接酶(AL)结合辅酶A到脂肪酸(ATP-反应).活化脂肪酸转移到第一结构域酰基载体蛋白(ACP1)的辅因子4-磷酸磷酸三钙.类似地,丙二酰CoA固定到ACP2 结构域.通过酮-酰基(KS)合成酶结构域催化的丙二酰基和酰基硫酯的缩合导致形成NL-酮酰基硫酯.通过转氨酶将NL-酮酰基硫酯转化为氨基脂肪酸.氨基脂肪酸可以通过缩合域转移到硫醇化结构域.

肽部分通常以核糖体非依赖性方式由被称为非核糖体多肽合成酶(non- ribosomal peptide synthase,NRPS)的复合酶合成.NRPS由几个协作的多功能模块组成,每个模块能够进行肽延长的一个循环.每个模块识别和激活一个构成氨基酸及其掺入新生脂肽产物所需的功能性构建单元.这些不同的任务由一组不同的催化结构域完成:腺苷酰化(A)结构域负责选择底物氨基酸并产生相应的氨酰基腺苷酸.随后,氨酰基部分共价连接到修饰的磷酸泛酰巯基乙胺基(Ppant)基团,其翻译后引入相邻的肽基载体蛋白(PCP)结构域.每次在缩合(C)结构域的催化控制下,肽基-S-Ppant 供体被单体氨酰基-S-Ppant 亲核体结合形成肽键.所得到的肽产物可以通过掺入单体的修饰(差向异构化或N-化)进一步官能化,并通过与末端模块融合的硫酯酶样(Te)结构域的作用释放后融合到末端模块上[21].

脂质部分可以通过氨基转移酶偶联到肽部分的生物合成的第一模块上固定的氨基酸.生物合成后,脂肽可以进行修饰,如通过与合成酶相关的特定酶实现糖基化或卤化.然而,最近的脂肽合成酶的分析表明,在微生物中存在几种NRPS结构的变体.通过编码基因的遗传工程修饰NRPS是产生有用变体的最有前途的方法,而近年来新兴的组合生物学技术为合成新脂肽提供了先进的理念和思路.

脂肽合成酶遗传信息的积累有助于利用组合生物学技术设计具有更高表面活性和(或)新特征的生物表面活性剂[22].本实验室对3 种微生物的产脂肽基因进行了分析,发现枯草芽胞杆菌和侧孢短芽胞杆菌都含有表面活性素、伊枯草素和芬枯草素合成基因,但二者的表达量完全不同,在微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflus)和比基尼链霉菌(Streptomyces bikiniensis)中只检测到了伊枯草素合成基因.这些信息能为脂肽相关研究提供参考.

5 脂肽的提取和纯化

通常,脂肽需要从其发酵上清液中提取和纯化后,才能在工业、医药、制药、农业和环境领域应用.在有氧喷射式培养过程中产生的强烈泡沫是脂肽化合物商业化的一个巨大障碍,使其从复杂的发酵液中的回收和纯化变得困难[23].在这种情况下,NichakornKhondee 等[24]用壳聚糖固定芽胞杆菌属细胞,解决了有氧生产脂肽过程中的发泡问题.固定细胞可以在搅拌式发酵罐中重复使用几个循环,即可维持高脂肽产量,又能使用简单的泡沫分馏塔装置来回收所产生的脂肽,从而达到部分纯化和浓缩脂肽的目的,分流出的泡沫体对许多石油样品显示出高表面活性,该方法相对易操作、成本低、并且对环境友好.

有效经济的回收和纯化脂肽是工业化生产的前提,目前,混合盐析、酸沉淀和超滤等多种下游处理技术联用是脂肽分离的主要手段[25],但是多种技术联用会导致产品的损失率上升、回收率降低[26],因此改良下游的分离提纯工艺依然是脂肽生产亟待解决的问题.笔者实验室发现硅胶柱层析虽然可以有效的分离某些脂肽,但是分离过程中用到的某些有机溶剂会明显降低脂肽的活性,因此分离过程中应尽量减少有机溶剂的使用.Muthusamy 等[27]通过两步超滤的方法提取发酵产物中的脂肽,根据脂肽聚集形成胶束的大小来选择最合适的MWCO (Molecular Weight Cut Off)膜,可以得到非常高的纯度,其中表面活性素的纯度达到94%,抗霉枯草菌素纯度达到90.02%,该方法不但降低了脂肽分离的繁琐程序,并且纯度和回收率也大大提高.

6 脂肽的应用

脂肽类物质在不同领域都有应用.在农业中可以作为生物控制剂来减少病虫害发生,在工业中可以作为驱油剂来提高石油开采量;在食品加工领域能够作为防腐剂来控制微生物污染;在畜牧业中被用作助长剂添加到饲料当中[10];在医药行业中可以作为抗菌剂、抗病毒剂、抗血栓剂[28].

6.1 在石油开采中的应用

脂肽表面活性剂在油田中的应用是微生物强化油采收的重要机制之一,具有水溶性好、反应产物均匀、安全无毒、驱油效果良好等优点,可以提高石油采收率和防止油井结蜡[29].在油田开发中,首次开发后油藏中仍有约70%的油剩余,使用脂肽类表面活性剂驱油,可以将采油量提高到80%~85%,且不会造成环境污染[30].在3 次驱油中还可以解决沥青质和石蜡沉淀堵塞输油管道影响原油运输的问题.人们还考虑将产生脂肽类表面活性剂的微生物直接注入到地下,以原油作为碳源并添加一定的营养物质,将油层作为生物反应器,以期提高驱油效率和降低成本.

6.2 在医药中的应用

脂肽类物质具有抗真菌、抗支原体、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、溶栓等作用,所以在医药方面有着良好的应用前景.枯草芽胞杆菌产生Surfactin 是第一个天然脂肽类商品,在当时被用做凝血抑制剂,该商品主要含有Surfactin、Iturin、杆菌霉素(Bcillomycin)和Fengycin 等,其中Surfactin 占76%以上[31].Liu[32]报道Surfactin 和Fengycin 可以杀死蜡状芽胞杆菌的休眠孢子和发芽孢子,对芽胞的最低抑菌浓度为156.25 μg/mL.达托霉素是第一个用做抗生素的脂肽类新药,商品名为Cubicin,其作用机制与其它抗生素不同,它能够扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成,改变细胞质膜的性质;还能通过破坏细菌的细胞膜,诱导膜脂双层的成孔和离子通道形成,使细胞内容物外泄而达到杀菌的目的[33].卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)、阿尼芬净(Anidulafungin)、棘白霉素(Echinocandin)等脂肽类抗生素已经应用于临床医学.CD Qian 等[34]发现的来自天竺葵弧菌(Paenibacillus tianmuensis)产生的一种新的阳离子脂肽抗生素(Battacin)对多药耐药性革兰氏阴性细菌具有活性.脂肽的抗菌活性可用于对抗在泌尿、、胃肠道以及皮肤中引起疾病和感染的微生物,在未来,有可能用于取代常规的抗生素.另外,Gao 等[35] 通过给小鼠口服脂肽类表面活性素中的WH1fungin 来治疗小鼠的糖尿病,效果良好,相信不久的将来就会投入到人类的医药当中.Zhao 等[36]报道了脂肽可应用于预防和治疗艾滋病毒(HIV).

6.3 在生物防治上的应用

鉴于植物病原微生物对现有农药的抗性增加,农业上对新的抗微生物剂有了更多的需求.众所周知,脂肽类物质对病原菌的生长具有抑制活性,已经作为“绿色农药”在作物保护方面引起了人们的关注.脂肽不但影响靶细胞膜的渗透作用,还影响细胞运动和生物膜的形成,并且能刺激植物的免疫应答[37].脂肽类物质对广泛范围的植物有害生物都具有很好的拮抗活性,可以用作真菌抑制剂、细菌抑制剂和杀虫剂.相对而言,脂肽抗植物病原真菌的研究较多,据报道,微生物源脂肽对霜霉菌(Peronospora sp.) [2]、镰刀菌(Fusarium sp.) [38]、青霉菌(Penicillium sp.)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 和晚疫病菌(Phytophthorainfestans)等丝状真菌[9]和酵母菌具有抗菌活性.脂肽在虫害防治方面的研究刚刚起步,Kumar 等[39]发现Iturin A 对最著名的农业害虫之一斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的整个生理过程都有显著的抑制作用,Iturin A是斜纹夜蛾中α-淀粉酶的抑制性化合物.最近的研究进展表明,脂肽不仅可以作为“拮抗剂”或“杀手”来抑制植物病原菌的生长,作为“扩展器”来促进植物根的定殖,还可以作为“免疫刺激剂”来增强宿主的抗性潜力[40].

7 展望

脂肽类化合物具有高效、低毒、无污染等优点,其作为生物表面活性素的功能已经在石油开采、降解农药残留[41]等诸多领域得到应用.近些年,鉴于其能够诱导细胞质膜成孔和离子通道的形成来破坏膜的完整性和扰乱膜渗透性的稳定,脂肽成为抗细菌剂、抗真菌剂和杀虫剂的研究对象;脂肽还可以破坏病毒的衣壳,表现出抗病毒、抗肿瘤等活性[3].为了推进脂肽在生物医学和农业领域的生产应用,解决限制其商品化的产量低、纯度低、成本高等主要瓶颈问题,今后脂肽的研发力度应集中在以下3 个方面:(1)利用共培养技术和组合生物学技术发现新脂肽和提高脂肽产量,加速脂肽的生产化进程.(2)利用多种技术联用的方式进行高产菌株的选育,提高脂肽的产量和菌株的遗传稳定性.(3)通过改良发酵条件和简化分离纯化工艺等措施来降低脂肽的生产成本,提高脂肽的产量和纯度.

研究进展论文参考资料:

论文进展

学位论文进展情况

本文结论:该文是关于对不知道怎么写微生物源脂肽和研究进展和微生物论文范文课题研究的大学硕士、研究进展本科毕业论文研究进展论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料。

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