黄瓜类本科论文怎么写 与关于二羧酸－三羧酸盐载体蛋白负调控黄瓜花叶病毒积累的初步相关论文写作技巧范文

《关于二羧酸－三羧酸盐载体蛋白负调控黄瓜花叶病毒积累的初步》

本文是关于黄瓜类本科论文开题报告范文与羧酸和花叶病和黄瓜相关论文写作技巧范文。

摘 要:黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)的复制场所位于液泡膜,但是参与调控CMV复制的寄主蛋白因子有待进一步研究.植物二羧酸三羧酸盐载体蛋白(Dicarboxylatetricarboxylatecarrier,DTC)为线粒体膜和液泡膜定位的跨膜蛋白,参与二羧酸盐和三羧酸盐的跨膜转运.为了探索DTC在CMV复制中的调控作用,通过基于烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus,TRV）的基因载体下调本氏烟体内DTC2（NbDTC2）的mRNA水平,并通过GFP荧光和Westernblot分析DTC2下调表达后对CMVΔ2beGFP积累量的影响,发现NbDTC2的下调表达增加CMV的积累水平；同时分析本氏烟DTC2的瞬时过表达对CMVΔCPeGFP积累的影响,通过观察eGFP荧光和Westernblot检测,发现NbDTC2的过表达在一定程度上抑制病毒的积累.以上结果表明：DTC2负调控CMV的积累,可能参与植物对病毒的防御.

关键词：黄瓜花叶病毒；复制；二羧酸三羧酸盐载体蛋白

中图分类号：Q933文献标志码：A文章编号：1673\|3851(2018)09\|0613\|06

0引言

黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是属于黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员,作为模式病毒已用于病毒致病性、病毒与寄主互作和病毒进化等方面的研究［1］.CMV是一种经济型重要的植物病毒,能侵染近1000种植物［23］.CMV是一种正义单链RNA病毒,其基因组是由三条正义单链RNA组成,按照大小依次命名为RNA1、RNA2和RNA3.CMV基因组每条RNA链的5’端均具有帽子结构,且3’端具有类似tRNA的结构(tRNAlikestructure,TLS)［45］.RNA1是单顺反子,编码具有转移酶结构域和解旋酶结构域的1a蛋白.RNA2编码含RNA聚合酶活性的2a蛋白,并通过其亚基因组RNA4A编码具有沉默抑制作用的2b蛋白［67］.CMV1a和2a蛋白负责CMV的复制.免疫组化实验显示CMV1a和2a蛋白定位于植物的液泡膜,由此推断CMV的复制场所为液泡膜［8］.RNA3编码两个开放阅读框(Openreadingframe,ORF),其5’端ORF编码移动蛋白(Movementprotein,MP),负责病毒的胞间移动和长距离移动［9］.

第二个ORF则通过其亚基因组RNA4编码外壳蛋白(Coatprotein,CP),负责病毒基因组的包装和参与病毒的长距离移动［1011］.植物内源的二羧酸三羧酸盐载体蛋白(Dicarboxylatetricarboxylatecarrier,DTC)定位于线粒体膜和液泡膜,负责二羧酸盐和三羧酸盐的跨膜转运［12］,参与氨基酸的初步合成、脂肪酸的代谢和类异戊二烯的生物合成等代谢途径［1315］.拟南芥仅编码1个DTC基因,而烟草则编码4个DTC基因,分别为NtDTC1、NtDTC2、NtDTC3和NtDT［16］.目前关于DTC蛋白的功能研究较少,尚未见有关该蛋白参与生物胁迫的报道.为了探索DTC蛋白在病毒侵染方面的是否具有一定作用,本文通过烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)诱导的基因沉默和植物中瞬时过表达方法,分析本氏烟中NtDTC2下调表达与过表达对CMV编码蛋白的积累量影响,初步确定NtDTC2在CMV侵染寄主中的作用.

1材料与方法

1.1试剂

Q5超保真DNA聚合酶购于NewEnglandBioLabs公司、限制性内切酶购于ThermoFisherScientific公司、凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购于Axygen公司、RTPCR试剂盒购于天根生物科技有限公司、eGFP抗体购于SantaCruzbiotechnology公司,常规生化试剂购于上海生工生物技术有限公司和Sigma贸易有限公司.1.2材料本氏烟(Nicotianabenthamiana)幼苗于植物生长室中恒温培养,温度为25℃,光周期为16h/8h(光照/黑暗),待幼苗培养至两周以上用于农杆菌浸润.CMV基因组RNA1、RNA2、RNA3的侵染性克隆pCB301R1、pCB301R2和pCB301R3为实验室前期构建和保存,构建方法参考文献［17］.增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)替换2bORF的侵染性克隆pCB301R2eGFP和eGFP替换CPORF的侵染性克隆pCB301R3eGFP,由本实验室构建和保存.病毒诱导的基因沉默载体pTRVRNA1(TRV1)、pTRVRNA2(TRV2)由清华大学刘玉乐教授实验室提供.1.3植物总RNA提取利用液氮将0.1g叶组织研磨粉碎,然后加入1.0mLRNA提取溶液(50mmol/LpH值5.2NaAC,10mmol/LpH值8.0EDTA和1%SDS),继续研磨至匀浆.吸取匀浆至RNasefree的1.5mL离心管中,加入等量的水饱和酚,涡旋混匀；在4℃,12000r/min条件下离心6min.之后吸取上清,按照3∶2的比例加入苯酚/氯仿混合液(1∶1混合),涡旋混匀；在4℃,12000r/min条件下离心6min后,吸取上清,然后用3倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/LNaAC(pH值5.2)沉淀RNA.最后,用DEPC水溶解RNA,利用Nanodrop测定所提RNA的浓度和纯度.1.4质粒的构建通过常规的克隆方法构建DTC2的VIGS沉默质粒.实验方法为：利用oligo(dT)12作为反转录引物,逆转录合成本氏烟总RNA的cDNA,并用特异的引物进行PCR扩增.RTPCR具体步骤根据天根生物科技有限公司RTPCR试剂盒提供的说明.以合成的cDNA作为模板,利用VIGS引物对VIGSNbDtc2F/VIGSNbDtc2R（表1）扩增片段DTC2VIGS,经过BamHI和SmaI消化后克隆至预先用相同限制性内切酶处理的载体pTRV2,经挑取单斑鉴定后提取质粒pTRV2DTC2.构建瞬时过表达本氏烟DTC2的质粒p35SDTC2.具体构建方法为：以本氏烟cDNA为模板,利用引物对Dtc2OEF/Dtc2OER（表1）扩增DTC2全长编码序列,经EcoRI和BamHI消化后克隆至预先用相同限制性内切酶处理的质粒p35SFlagHA,获得重组克隆质粒p35SDTC2.所有质粒需经序列测定以保证序列的准确性.质粒转化农杆菌,挑斑鉴定后,保存于-80℃.

表1构建质粒的引物序列引物名称引物序列1.5农杆菌浸润接种取50μL保存于-80℃的农杆菌(含相应的质粒)于含有抗生素利福平(30mg/L)、庆大霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的5mL的LB液体培养基中,于28℃摇床,220r/min的条件下培养16h对菌种进行菌种活化和扩大培养,离心收集各个农杆菌的菌体,最后将菌液悬浮于浸润缓冲液(10mmol/LMgCl2、10mmol/LMES和200mmol/L乙酰丁香酮)中.利用分光光度计测量菌液在600nm下的OD值,调整TRV1、TRV2DTC2、TRV2菌液OD值为0.2,调整35SDTC2、35SFlagHA、pCB301R1、pCB301R2、pCB301R3、pCB301R2eGFP以及pCB301R3eGFP菌液OD值为0.5.按照TRV1与TRV2DTC2、TRV1与TRV2的组合将菌液等体积混合.混合后的菌液于暗处放置2~3h,通过注射器接种于4~5叶期本氏烟.CMV注射后5d,在紫外灯下观察GFP荧光,并拍照保存.1.6本氏烟总蛋白提取及Westernblot检测从0.2g叶组织中提取植物总蛋白,具体操作方法参考文献［18］.蛋白样品需经酶标仪定量后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离.利用转膜仪,在电压100V的条件下转膜1h,将蛋白质转移至硝酸纤维素膜.为了分析CMV编码的eGFP的积累量,利用eGFP多克隆抗体进行蛋白杂交检测.结合一抗和二抗后,分别在TBST中洗膜三次,每次10min,之后在TBS中洗膜10min.利用ECL检测膜并通过X射线胶片的放射自显影来显现蛋白的特异性条带.2结果与分析2.1pTRV2DTC2重组克隆的构建从本氏烟中提取植物总RNA,通过反转录得到本氏烟的cDNA,以cDNA为模板,利用VIGSNbDtc2F/VIGSNbDtc2R引物对扩增DTC2VIGS的DN段,片段预期大小约300bp.PCR产物的电泳结果如图1(a)所示,PCR产物的扩增片段位于略高于250bp条带的位置处,其大小与预期片段大小相符.将PCR扩增获得的目的DN段经BamHI和SmaI酶切,克隆至pTRV2载体,获得pTRV2DTC2重组质粒,其电泳结果如图1(b)所示.重组质粒经PCR鉴定和测序,确定重组质粒含有目的片段的插入,且序列未见任何的突变.

图1pTRV2DTC2质粒的构建

2.2pDTC2OE质粒的构建以本氏烟的cDNA为模板,利用Dtc2OEF/Dtc2OER引物对扩增DTC2的全长cDNA,片段大小约800bp,PCR产物的电泳结果如图2(a)所示.PCR扩增产物位于750~1000bp条带之间,与预期的片段大小相符.将PCR扩增获得的DTC2OE片段经限制性内切酶EcoRI和BamHI消化后,克隆至载体p35SFlagHA,获得过表达重组质粒p35SDTC2.电泳检测质粒p35SDTC2如图2(b)所示,电泳图显示质粒p35SDTC2的大小与预期相符.质粒经PCR检测和序列测定,确定为含有目的片段的阳性克隆.图2p35SDTC2质粒的构建2.3TRV下调的DTC2mRNA对CMV积累的影响为了沉默本氏烟体内的DTC2mRNA,将TRV1和TRV2DTC2混合注射入本氏烟叶片,并以混合注射TRV1和TRV2作为阴性对照.注射后12d,在注射叶的上部叶片接种CMVΔ2beGFP.接种病毒5d后,在紫外灯下观察各个处理的绿色荧光,结果如图3所示.与阴性对照组TRV2处理的植株相比,CMVΔ2beGFP在TRV2DTC2处理的叶组织中呈现更强的绿色荧光.在接种病毒后5d,采取病毒接种叶,并提取其总蛋白；以Rubisco为二磷酸核酮糖氧合酶,作为植物内参蛋白用于确定蛋白的上样量,通过Westernblot检测接种叶中eGFP的积累量,结果显示：eGFP的积累量在TRV2DTC2处理的叶组织中比对照组提高48%(图4),因此DTC2的下调表达促进CMV携带的eGFP蛋白的积累,初步说明DTC2对CMV侵染本氏烟具有负调控作用.图3紫外灯下观察DTC2下调后CMVΔ2beGFP

病毒产生的GFP荧光

图4Western杂交检测DTC2下调对后

CMVΔ2beGFP病毒蛋白积累量

2.4DTC2的过量表达对CMV积累的影响为了进一步分析DTC2对CMV积累的负调控作用,本文通过农杆菌介导的瞬时过表达方法,测定DTC2的过表达对CMV积累的影响.在同一叶片上注射3个浸润斑,分别为Mock(只接种浸润缓冲液)、Vector(35SFlagHA)和35SDTC2.浸润3d后,在原来的浸润斑的位置接种CMVΔCPeGFP,Mock组仍只接种浸润缓冲液.病毒接种3d后,在紫外灯下观察绿色荧光的强度,结果如图5所示.在Vector和35SDTC2处理的区域均出现明显的GFP绿色荧光,表明CMVΔCPeGFP接种区域已有效地复制和翻译.与对照Vector相比,过量表达DTC2蛋白的注射斑的绿色荧光相对较弱.病毒接种3d后分别采取每个注射斑的叶片样品,利用Westernblot检测eGFP的积累量.结果显示,本氏烟中过量表达DTC2蛋白后,CMV携带的eGFP的积累量与对照组相比减少24%(图6),这表明DTC2对CMV确实具有一定的影响,进一步说明DTC2对CMV有一定的负调控作用.图5紫外灯下观察DTC2过表达对CMVΔCPeGFP

产生GFP荧光的影响

图6Western杂交检测DTC2过表达对CMVΔCPeGFP

产生的GFP蛋白积累量的影响

3讨论就DTC蛋白的功能而言,除了跨膜转运二羧酸盐和三羧酸盐的功能之外［15］,尚未有其它功能的报道.本文通过基因沉默和过表达本氏烟DTC2,初步确定DTC2负调控CMV的积累.寄主因子负调控病毒积累的途径包括降低病毒RNA的翻译和复制效率以及降低病毒RNA的体内稳定性.拟南芥编码的RNA结合蛋白APUM5通过结合CMVRNA的3’UTR,抑制病毒RNA的翻译,从而负调控病毒的积累［19］.siRNA介导的抗病毒沉默是降低CMVRNA稳定性的主要途径,但是,CMV通过其编码的RNA沉默抑制子2b蛋白竞争性地结合siRNA,能有效地抑制寄主的抗病毒RNA沉默［2021］.由于本氏烟DTC2与CMV的复制场所均位于液泡膜,本氏烟DTC2可能参与调控CMV的翻译或复制.除了寄主的蛋白因子之外,膜脂质也参与病毒的复制,并扮演重要的角色.磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)和卵磷脂(Phosphatidylcholine,PC)分别正调控番茄丛矮病毒(Tomatobushystuntvirus,TBSV)和雀麦花叶病毒(Bromemosaicvirus,BMV)的复制［2223］.DTC介导的二羧酸盐和三羧酸盐的跨膜转运能够参与脂肪酸的代谢途径［1415］.因此,本氏烟DTC2的下调表达或过表达有可能影响植物体内脂质的合成代谢,从而间接地影响CMV的积累,关于DTC2调控CMV积累的分子机制仍有待进一步的研究.4结论本文通过构建DTC2的沉默载体以及过表达载体,在本氏烟中下调表达或过表达DTC2后,Westernblot分析CMV编码的GFP量的变化,主要结论如下：a)本氏烟DTC2下调表达促进CMVΔ2beGFP的积累；b)本氏烟DTC2过表达抑制CMVΔCPeGFP的积累.基于以上结果,初步确定本氏烟DTC2蛋白在植物中负调控CMV的积累,DTC2调控CMV侵染寄主植物的分子机制有待于进一步研究.

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PreliminarystudyonthenegativeregulationofCucumbermosaicvirus

accumulationbydicarboxylatetricarboxylatecarrier

GAOShuangyu,DUZhiyou

(CollegeofLifeSciences,ZhejiangSciTechUniversity,Hangzhou310018,China)Abstract：ThereplicationsiteofCucumbermosaicvirus(CMV)islocatedonvacuolarmembrane,butthehostproteinfactorsinvolvedinCMVreplicationneedfurtherstudy.PlantDicarboxylatetricarboxylatecarrier(DTC)isthetranembraneproteinthatlocatesthemitochondrialmembraneandvacuolemembrane,andisresponsiblefortransportationofdicarboxylateandtricarboxylate.ToinvestigatetheregulationroleofDTCinCMVreplication,mRNAlevelofDTC2(NbDTC2)inNicotianabenthamianwasloweredthroughthegenophoreofTobaccorattlevirus(TRV).TheinfluenceofCMVΔ2beGFPaccumulationafterdownregulationofDTC2wasanalyzedwithGFPfluorescenceandWesternblot.Itwaoundthat,thedownregulationofNbDTC2increasedtheaccumulationlevelofCMV.Meanwhile,theinfluenceoftransientoverexpressionofDTC2onaccumulationofCMVΔCPeGFPwasanalyzed.TheresultsofGFPfluorescenceandwesternblotshowedthatoverexpressionofNbDTC2inhibitedaccumulationofthevirustosomeextent.Theaboveresultsindicatethat,DTC2negativelyregulatesCMVaccumulation,whichmayparticipateinthedefenseagainstCMV.Keywords：Cucumbermosaicvirus;replication;dicarboxylatetricarboxylatecarrier(责任编辑：唐志荣)

黄瓜论文参考资料：

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