原创《昆虫性信息素结合蛋白功能进展》
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摘 要：嗅觉系统在昆虫的生命活动中具有重要的功能作用.通过嗅觉蛋白来识别环境中以及种内所释放的化学信号物质,进而指导昆虫完成求偶,躲避天敌等生命活动.近些年来,随着转录组测序技术的日益发展,许多昆虫的嗅觉家族相关基因已被鉴定.而性信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBPs)因其功能的特殊性与重要性,一直以来备受研究者的关注.目前,丰富的科学手段,例如电压钳,RNAi,EAG等已为嗅觉蛋白功能做出了不同的阐述,并有一些新的发现,但目前尚存在一些问题亟待解决.笔者根据国内外近些年的研究进展,从昆虫性信息素结合蛋白的理化性质、不同组织表达模式及其与其他嗅觉相关蛋白之间的关系等方面进行了综述.
关键词：性信息素结合蛋白；触角；昆虫；嗅觉基因；功能
中图分类号：Q966 文献标志码：A 论文编号：cjas16110038
0 引言
昆虫的嗅觉系统在其适应环境的过程中发挥了不可替代的作用,对其寻找配偶及产卵场所,躲避天敌等行为产生了重要影响[1-2],其中求偶交配行为对于昆虫种群的繁衍发展等具有重要的意义.昆虫脑部触角叶一般由两个平行亚系统组成,一个主要负责处理寄主植物气味,而另一个特化为专门处理种内或相似种之间的性信息素[3].目前,研究者已就普通气味结合蛋白(General Odorant Binding Proteins,GOBPs)和性信息素结合蛋白(Pheromone Binding Protein,PBPs)分别作为气味结合蛋白(Odorant Binding Proteins,OBPs)开展了广泛研究.关于求偶交配行为发生的第一步,目前被普遍认为是性信息素结合蛋白识别并结合性信息素分子后,将其运输至嗅觉受体发生级联放大反应,进而指导昆虫进行求偶行为.
昆虫对性信息素分子的识别主要由分布在触角上的感受器完成,气味分子能够穿过感受器表面布着的微孔(Pore)进入触角感受器,与淋巴液中相对应的气味结合蛋白结合,而后被运送至感觉神经元膜上的气味受体(Olfactory Receptor,ORs)[4].性信息素结合蛋白首先在多音天蚕(Antheraea polyphemus)中被分离、鉴定,因其能够与信息素特异性结合而命名为性信息素结合蛋白[5].随后Sandler 等首先通过X-射线对家蚕PBP晶体结构进行了分析,发现由6 个反向平行的α螺旋构成的烧瓶状结合兜可以与性信息素成分特异性结合[6].目前,随着不同昆虫性信息素成分以及植物挥发物成分被鉴定,越来越多的研究者将其作为研究对象,旨在为害虫监测及防治提供策略,从而达到绿色防治的目标.为阐明性信息素分子等气味分子与性信息素结合蛋白的运输及作用机制,引发了学者们对性信息素结合蛋白结构与功能的研究兴趣.
1 性信息素结合蛋白的分子特征
昆虫的PBPs是一类由120~160 个氨基酸组成的酸性、水溶性的小蛋白分子.随着家蚕、果蝇等模式昆虫的嗅觉相关蛋白研究日益深入,棉铃虫、舞毒蛾、梨小食心虫等昆虫的嗅觉相关基因也逐步被鉴定.根据已有研究的分析发现它们存在以下2 个共同点：（1）其N端的信号肽序列约有20 个氨基酸,而其功能蛋白则将信号肽切除；（2）尽管PBPs 蛋白序列比对结果显示其一致性在30%~75%,但一般都具有6 个保守的半胱氨酸,并通过特定的组合方式形成3 个二硫键.此结构一方面可以稳定蛋白结构,另一方面二硫键所形成的α螺旋疏水结合腔可以调控性信息素分子的结合与释放.
PBPs 在水溶性的血淋巴（感器液）中选择性地结合性信息素分子而过滤掉其他无关的气味分子,与性信息素分子形成复合物后与树突膜上的G-蛋白偶联受体相作用并引发级联放大反应,从而激活信号通路[7-8].然而,关于性信息素结合蛋白是以何种形式将性信息素分子传递给性信息素受体存在3种推测：一为气味结合蛋白与气味分子结合在到达受体后将其释放,气味分子单独与神经膜上受体蛋白作用；二为气味结合蛋白与气味分子以结合体的形式与气味受体发生作用；三为气味结合蛋白将气味分子运送到神经膜后,先与跨膜蛋白结合而释放出气味分子,接着气味分子再与神经膜上的受体作用[9-11].但是配基与配体以何种方式与受体的结合及释放机制尚未明确,相关研究表明它们之间的结合与释放方式均与气味分子的构象、嗅觉感器腔内淋巴液的pH值、热以及神经元膜附近的盐离子浓度等密切相关[4,12].
目前很多研究表明PBP 功能的发挥与环境的pH相关.在家蚕的研究中发现性信息素结合蛋白可分为还原性和氧化型,当pH 8.2 时该蛋白为碱式构型(BmorPBPB),可以将性信息素运送至受体；当pH 4.5时为酸式构型(BmorPBPA),可将性信息素从受体释放出来[13,6].在动力学研究中证实当信息素被运至神经元树突膜并同受体结合后,性信息素结合蛋白变成具有清除信息素功能的氧化型.Ziegelberger 等[14]通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳发现在多音天蚕蛾中性信息素结合蛋白的氧化态和还原态可以共存.另外,PBPs 功能行使与蛋白构象的变化相关联.在脐橙螟的PBP1 的研究中发现当酸碱度从pH 4.5 升高到pH7.0 后,N-端α1 螺旋为了协调C-端α7 螺旋发生约92°的旋转,自身发生了大约37°旋转；正是这种结构转变所造成的挤压作用使C端形成的第7 个α-螺旋进入结合兜内并取代信息素分子的位置,最终将信息素分子逐出以激活性信息素受体[15].因此,阐明pH 对PBPs 结构的影响将会使人们深入了解PBPs 作用的分子机制.此外,Wojtasek 等[16]在家蚕中的研究表明BmoriPBP 在pH 5.0~6.0 之间构象会发生巨大的变化,即Bmori PBP对pH存在很高的敏感性,但它对于热以及尿素的变性作用却具有很高的稳定性.
但Weng 等[17]研究发现在中华蜜蜂性信息素气味结合蛋白ASP1 与蜂王信息素HOB的结合关系却随着温度的升高结合力逐渐下降,此研究结果与Wojtasek发现PBP对热稳定的结果却显著不同,可能是由于不同昆虫之间的分子机制存在的差异造成的,通过光谱分析发现ASP1 在结合HOB后亲水性会发生一些变化并伴随着α螺旋的增多.简言之,PBPs 的构象变化受到一些因子的影响,并借助于这些因子变化所提供的能量来完成自身结构的转变,最终完成对性信息素分子的结合与释放.
2 信息素结合蛋白作用的关键位点
随着不同昆虫的PBPs基因被克隆,其功能也逐渐明确.为了深入了解该类蛋白起功能作用的关键位点,学者们也进行了不懈的探索.目前研究PBPs与配体之间结合的关键位点的方法主要有：圆二色性光谱(Circular Dichroi,CD)、定点突变、同源模建、分子对接、荧光竞争结合试验等.通过比对多种昆虫的PBPs序列发现其氨基酸序列中第69 位和70 位的组氨酸具有高度的保守性.利用圆二色性光谱对多音天蚕的PBPs 的研究发现PBP1 与性信息素分子4E,9Z-14:Ac结合后蛋白结构会发生显著的变化,而与6E,1Z-16:Al结合时只有微小的变化；PBP2 与6E,11Z-16:Al 结合后却能够发生明显的构象变化；然而PBP3 却不能够与性信息素化合物中的任意一种成分相结合[18].因此,推测这两个位点可能与配体诱导PBPs 构象的变化有关,随后利用位点突变试验证明了组氨酸确实参与了这种构象的变化.在舞毒蛾的研究中利用突变能量计算预测PBPs互作的关键位点,并通过表达突变蛋白并结合荧光试验发现PBP1 的第41 位的酪氨酸和第76位的苯丙氨酸可能是稳定蛋白结构的关键氨基酸；而稳定PBP2 蛋白结构的关键氨基酸可能是第49 位的甘氨酸、76位的苯丙氨酸以及第121位赖氨酸[19].
根据昆虫中已鉴定出PBPs基因发现,有些昆虫中只存在1 种PBP,例如家蚕等.有些昆虫有多种PBPs,例如小地老虎存在3 种PBPs,亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)触角中有PBP4 和PBP5 的存在[20-22].这种结果说明：昆虫中有存在着不同的PBPs可能用来识别不同的性信息素分子.另外,可能尚存在未被发现的PBPs.通过氨基酸序列比对发现,同种昆虫PBPs 之间的序列一致性并没有同类PBP之间的一致性高,推测可能是由于昆虫PBP基因有着共同的祖先,由于进化过程中的选择压力而出现了分化,从而使得不同PBPs 具有识别不同性信息素的功能[23].关于不同种类的PBPs 在棉铃虫中的研究发现Harm PBP1 与棉铃虫的两种性信息素分子均有很强的结合力,而HarmPBP2 和Harm PBP3 与这两种性信息素分子却仅有很弱的结合能力[24].进一步试验发现烟青虫和棉铃虫的3 个PBPs分别结合的最佳性信息素分子在C链长度上有明显的区别：PBP1 可以与具有13-15 个C原子的性信息素较好地结合,而PBP2 和PBP3 能够与具有12~14 个C原子的性信息素较好地结合[25].此外,在舞毒蛾的PBP2 研究中发现,性信息素分子的羟基和羰基一端适当的链长有利于PBPs的结合[26].相似地,Quan等[27]在飞蝗OBP1 的研究中发现该蛋白可以与含15~17 个碳原子的醇、酮等化合物有很高的结合力,说明其具有结合长碳链的特异性.斜纹夜蛾的3 种PBPs中Slit PBP1 不能够与任何一种性信息素分子结合,Slit PBP2 与4 种性信息素分子均可以较好地结合,然而Slit PBP3 与其中2 个只存在较弱的结合能力[28].尽管嗅觉相关蛋白家族基因具有相似的结构,关于PBPs与性信息素分子之间的识别机制已展开广泛的探索,并且正在深入研究PBPs中起结合作用的关键位点,但目前尚未明确地阐明PBPs 发挥功能作用的关键位点所在.目前虽然关于PBPs 的荧光竞争结合实验研究发现它们可以与某些植物挥发物、性信息素分子类似物以及结构相近的化合物等发生一定程度的结合,但关于这些物质是否能够真正引起昆虫的生物学反应,则需要进一步的实验研究.
3 昆虫中PBPs 不同表达模式
现阶段昆虫PBPs的功能已基本明确,主要有过滤作用、运输作用、清除作用、性信息素的降解等[29-30].此外,不少研究也表明在性信息素受体识别性信息素的过程中,PBPs 除了载体的功能外,还可以提高性信息素与性信息素受体之间的结合效率,从而促进性信息素与受体之间的反应.昆虫的各组织部位分布着的丰富感器使昆虫能够敏锐地对外界环境做出反应,因此能够保障昆虫在不同龄期完成相应的生命活动.与关注昆虫中不同类的PBPs 一样,雌雄昆虫之间、不同龄期以及不同组织所表达的PBPs 类型同样引起了研究人员的兴趣.
3.1 时间表达特征
昆虫中PBPs 基因的表达高峰期基本都处于成虫期,而卵期及蛹期仅微量表达,幼虫期几乎不表达[31].例如在桃蛀螟PBP1 的研究中发现在其成虫阶段的表达量最高,卵期仅微量表达,幼虫期和蛹期均没有检测到PBP的表达,但在棉铃虫PBPs的表达模式研究中发现PBPs 在大约羽化前4 天便已经开始表达,并能够在羽化前2 天达到高峰；而关于成虫期,舞毒蛾PBPs 的研究结果显示,PBP1 和PBP2 在其羽化前4 天就已经开始合成,并在随后的整个成虫期都持续高表达[32-33].
与此不同的是,在桃蛀螟PBP1 的研究中发现4 日龄雌蛾触角中PBP1的表达量是其1日龄表达量的3.4倍[34].因此,可以推测PBPs主要在昆虫成虫期的求偶交配过程中发挥作用.在中华密蜂性信息素结合蛋白(Ac-ASP2)的基因表达谱中发现Ac-ASP2 在成虫期的表达量高峰期与其筑巢、采蜜等行为活动时间比较符合,因此这些活动进行可能与Ac-ASP2 的表达相关[35].虽然不同昆虫的时间表达谱不尽相同,但这些结果可能暗示着PBPs 不同时间的表达与昆虫在其相应龄期完成生命活动的生物学意义相关.
3.2 不同组织表达特征
昆虫嗅觉系统所发挥的重要作用主要依赖于触角,因此大多数嗅觉相关蛋白在触角中特异性表达.研究表明多数鳞翅目昆虫的PBPs 特异地表达在触角毛形感受器(sensillatrichodea)中,用来特异性地识别性信息素分子,但随后在其他昆虫中的器官如跗节和口器中也偶有发现[36].对小地老虎PBP1-3 的组织表达谱分析发现,小地老虎的3 个PBPs 虽然在触角中明显高表达,在味觉器官的喙及下唇须中存在少量表达,在头,胸,腹等部位的表达量则非常低[37].有趣的是,在小菜蛾的研究中发现雌蛾的性腺以及雄蛾的足中也有PBPs基因的表达,这种现象的存在则表明雌蛾可能在识别雄虫性信息素或检测自身所释放性信息素发挥着关键的作用[22].关于足部表达的PBPs 基因则可能与雌蛾寻找产卵场所相关：当雌蛾产卵时其性信息素也随之分泌,而当同种雌虫在同一寄主的同一部位产卵时,能敏锐地接收到此性信息素信号并转移至新的寄主,最终避免后代之间的食物竞争以有利于后代的繁衍.
3.3 雌雄二性表达特征
PBPs除具有OBPs的一般特点及能与性信息素特异性结合的功能外,还具有明显的性二型性.起初研究者们认为PBPs仅在雄性昆虫触角中特异性表达,但在随后的研究中发现雌虫触角也存在PBPs,例如小地老虎的3 个PBPs 在雌蛾触角的毛形感器中也均有表达[37],只是大多数都是在雄性昆虫中的表达量显著高于雌性.而斜纹夜蛾的PBPs 研究发现3 个PBPs 表达存在显著的性别倾向,雄蛾主要表达PBP1 和PBP2,而雌蛾主要表达PBP3[38].与之不同的是,烟草天蛾(Manduca sexta)雌雄蛾触角中的PBPs 之间的表达量并没有差异[28].因此,PBPs 雌雄昆虫之间除了表达量上的差异之外,所表达的PBPs 的基因种类也有所不同.在先前的研究中表明昆虫中雌蛾释放的性信息素在空气中传播,由雄蛾接受刺激后而发生远距离的定向飞行并准确定位雌蛾的位置,进而发生求偶交配行为.然而有研究表明雄虫所释放的信息素可以显著增加雌雄昆虫的交配成功率,当雄蛾接近雌蛾后,便开始释放雄性信息素抑制雌蛾继续释放雌性信息素,这样可以避免其他同种雄蛾发生求偶行为,从而促进交尾.
4 性信息素结合蛋白与其家族相关蛋白的功能关系
4.1 性信息素结合蛋白与普通气味结合蛋白之间的关系
目前,研究者已把昆虫嗅觉相关蛋白研究对象从成虫转移到了幼虫.研究发现当小菜蛾幼虫在有其主要性信息素分子(Z)-11-十六碳烯存在时,可以对其食物表现出明显的趋向,说明幼虫对性信息素分子也具备一定的识别能力；通过免疫细胞化学发现GOBPs在幼虫期高表达,并且没有检测到PBPs 基因的表达,进一步的试验表明GOBPs 确实参与了性信息素分子的识别作用[39].幼虫所具有的这种嗅觉本能可能是雌蛾所赋予的,这样使得幼虫对寄主植物的定向更加敏捷,并可以避免种群之间的食物竞争.在基因进化研究中发现,虽然鳞翅目昆虫的PBPs与GOBPs之间仅有32%~57%的一致性,但它们却可以构成一个单系群[40],并且在家蚕的研究中发现家蚕的PBPs 与GOBPs亚家族基因簇中的基因很相似,说明他们很有可能来自同一祖先基因的复制[41-42].在中华蜜蜂的研究发现ASP1 可以与某些植物挥发物结合后在一定程度上可能发挥协同作用[43].
而在梨小食心虫的3 个普通气味结合蛋白(OBP)研究中发现GmolOBP8 和GmolOBP11 既参与寄主挥发物又参与性信息素分子的识别与结合[44].在甜菜夜蛾普通气味结合蛋白SexiGOBP2 的研究中发现SexiGOBP2 对性信息素分子的结合能力较SexiPBP1更强,并且SexiGOBP1-2 和SexiPBP1-3 均能够与植物气味有不同程度的结合,SexiPBP1 在性信息素的识别上发挥最重要的功能[45].另外,在一些研究中发现性信息素结合蛋白还可以与植物挥发物等气味分子有不同程度的结合,因此,推测PBPs 可能有运输信息素和普通气味分子的双重作用[46].在性信息素的增效剂研究中,也有一些研究者将植物挥发物成分添加到性诱剂中来增强田间害虫的预测预报及防治作用.
4.2 性信息素结合蛋白与性信息素受体蛋白之间的关系
现阶段诸多的研究表明昆虫在接受气味分子并完成信号的转导过程中需要有多种嗅觉相关蛋白的参与,例如性信息素受体(pheromone receptors,PRs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)等.其中性信息素受体作为介导化学信号传递的基础,也逐渐地被大家关注.在家蚕与多音天蚕的研究中发现受体神经元的反应依赖于性信息素成分与PBPs,其中PBPs有助于激活受体神经元(Olfactory Receptor Neurons,ORNs)；通过进一步试验发现PBPs 与性信息素分子所形成的复合物不能激活家蚕的受体神经元,但可以激活多音天蚕的受体神经元.因此,也未发现PBPs与受体之间的运输与识别机制[47].而在PBPs 结合配体后的下游功能研究中发现,一种气味结合蛋白受体OR可以与多种气味分子结合,并且同一气味分子也可被多个受体识别,如此便形成了复杂的编码谱,其组合关系如图1[48-49].并且进一步的研究发现受体蛋白的结合作用与性信息素结合蛋白的类似,诸如在和气味分子结合时与其C链长度相关,因此OR可能与PBPs 的构象变化及其结合位点等方面存在相同的机制.
5 结论
PBPs 最初因其可以特异性地识别性信息素分子而被命名为性信息素结合蛋白,而现在越来越多的研究表明PBPs还可以与植物挥发物、性信息素类似物等结合.在这些研究中通过分子对接等技术方法,尽管可以在化学结构层次上对配基与配体之间的结合方式作出说明,但是这些化学物能否对昆虫的生物学例如趋避性等方面产生的影响,还有待于进一步的研究.相对来讲昆虫的趋向性更受学者们青睐,自从驱蚊剂应用以来,驱避剂的开发也逐渐进入学者们的研究范畴.之前的研究中发现大蒜精油的成分对许多贮藏害虫有杀虫活性,并能够导致麦蛾的产卵量减少,而进一步研究发现大蒜中的二烯丙基三硫醚(DiallylTrisulphide,DATS)可能干扰雌麦蛾释放性信息素而打断与雄蛾的交配[50-51].虽然昆虫的嗅觉蛋白家族存在广泛的编码谱给研究者们增加了不少工作量,但同时也提供了新的研究思路.如在性信息素增效剂方面,采用风洞技术发现将植物挥发物成分添加到性诱剂中可以增加苹小卷叶蛾雄虫飞向性诱剂的比率,通过实时记录发现在行为反应上4 种植物产品可以缩短苹小卷叶蛾雄虫飞向性诱剂的时间[52].另外,一些气味结合蛋白及普通气味结合蛋白也可以与昆虫的性信息素分子结合,例如,在梨小食心虫的2 个GOBP的结合试验中发现rGmolGOBP1 具有双重作用既可以与寄主挥发物结合又可以与性信息素分子结合,而rGmolGOBP2则主要参与性信息素分子的识别[53].
不同昆虫中存在着不同种类的性信息素分子以及不同数量PBPs,但越来越多的研究表明其主要结合作用只有一种.另外,在有些昆虫中雌蛾触角及性腺等组织也同样存在PBPs,或与雄虫相同或具有其独有的PBPs.因此,如果能够在雌蛾研究中揭示其PBPs 的功能及识别机制,将有可能解决目前常用的性诱剂只能诱捕雄虫的这一缺陷,同时能够为害虫的预测预报提供理论基础.
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