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植物类本科毕业论文范文 跟玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体的构建类硕士学位论文范文

版权:原创标记原创 主题:植物范文 类别:毕业论文 2024-01-19

《玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体的构建》

该文是植物有关学术论文怎么写与表达载体和ZmSUT4和玉米类学术论文怎么写。

弓雪,姜敏,齐欣,等. 玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体的构建[J]. 江苏农业科学,2016,44(7):42-44.

doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.011

玉米ZmSUT4基因RNAi植物表达载体的构建

弓雪, 姜敏, 齐欣, 李明, 马骏, 刘欣芳, 王延波

(辽宁省农业科学院玉米研究所,辽宁沈阳 100161)

摘 要:蔗糖转运蛋白(sucrose transporters,SUCs或SUTs)是蔗糖装载、卸载、分配的重要载体,ZmSUT4是玉米低亲和、高转运能力SUT4亚族的唯一成员.以黄早四ZmSUT4全长cDNA序列为模板,设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,PCR扩增获得正向、反向2个片段,将反向、正向片段双酶切后依次插入pGreen-HY104植物表达载体中,从而构建由35S启动子调控的ZmSUT4基因RNA干扰(RNAi)的植物表达载体HY104-A-S,然后通过冻融法将载体质粒转入含有pSoup质粒的农杆菌EHA105中.ZmSUT4基因RNAi的植物表达载体的构建为研究ZmSUT4基因的功能奠定了基础.

关键词:玉米;ZmSUT4基因;RNAi植物表达;载体构建

中图分类号:S513.03;Q782 文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2016)07-0042-03

收稿日期:2016-01-21

基金项目:国家自然科学基金(编号:31401392);辽宁省博士启动基金(编号:201501112);国家转基因重大专项(2014ZX08003-004、2014ZX08003-003).

作者简介:弓雪(1983—),女,辽宁建平人,博士,助理研究员,主要从事玉米分子育种及新品种选育工作.Tel:(024)31029981;E-mail:gx2114@163.com.

通信作者:王延波,博士,研究员,主要从事玉米遗传育种研究.Tel:(024)31028888;E-mail:lnwangyanbo@163.com.

玉米的籽粒产量主要取决于籽粒形成过程中成熟叶片(源)光合产物的生产、韧皮部的运输(流)以及在籽粒(库)中的积累.光合产物的分配运输是植物体内源、流、库相互协调的结果,源足、库大、流畅是高产的基础[1-2].目前对源、库的特性研究较多,但是由于受研究方法和条件等限制,如对DNA序列了解的限制,对流的了解还相当不足.研究发现,随着种植密度增加,收获指数快速下降,表明在较高密度条件下,流对产量的限制作用在增加[3].流包括韧皮部的装载、筛管中运输、韧皮部卸出和同化物的重新吸收.蔗糖作为高等植物光合同化物运输的主要形式,也是联系源库之间主要的糖类[4].细胞膜上的蔗糖转运蛋白(sucrose transporters,SUCs或SUTs)承担着蔗糖从源细胞的外运、韧皮部的装载和卸载,以及向库细胞的装入功能,从而影响蔗糖的运输方向、速率和分配,其基因表达受多种环境因子的调控.ZmSUT4是玉米体内唯一的高蔗糖转运能力SUT4亚族成员,在植物体内的蔗糖运输和分配过程中发挥着不可替代的重要作用.但是,关于玉米SUT4的研究才刚刚起步,李志鹏仅利用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测ZmSUT4在玉米籽粒灌浆期花柄、籽粒等库器官的表达情况,未构建RNA干扰载体,分析ZmSUT4表达被抑制对植株生长发育及相关基因表达的影响[5].本研究利用ZmSUT4基因的全长cDNA序列,构建ZmSUT4基因RNA干扰载体,为进一步研究ZmSUT4基因的生理效应及作用机制奠定基础,也为研究其他SUTs基因的功能提供参考.

1材料与方法

1.1材料与试剂

所用玉米材料为玉米优良自交系黄早四.

KAPA Hifi高保真DNA聚合酶,购自美国KAPA Biosystems公司;T4-DNA连接酶、限制性内切酶,购自NEB公司;植物总RNA提取试剂盒、Quantscript RT Kit(cDNA第1链合成试剂盒)、质粒小提试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒,购自北京TIANGEN公司;pEASY-T、大肠杆菌DH5α,购自北京全式金生物技术有限公司;DNA marker DL2000,购自TaKaRa公司.引物合成和测序由上海立菲生物技术有限公司完成.Taq酶、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)等试剂,购自生工生物工程(上海)股份有限公司.植物表达载体pGreen-HY104质粒及含有pSoup质粒的农杆菌EHA105,均由国家玉米改良中心徐明良实验室提供.

1.2试验方法

1.2.1玉米ZmSUT4基因cDNA序列的获得利用植物总RNA提取试剂盒提取黄早四幼苗总RNA,利用反转录试剂盒获得黄早四全长cDNA序列.

1.2.2干扰片段的选择及引物设计根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已发表的玉米ZmSUT4基因的全长cDNA序列,选择该序列上的特异片段及表达载体pGreen-HY104的限制性内切酶酶切位点,并设计引物.分别在5′端加上PstⅠ-EcoRⅠ、BamHⅠ-XhoⅠ酶切位点,引物序列为:F:5′-GCTGCAGAATTCGTCTGGAAACTCTTTGTGGGT-3′;R:5′-CGGATCCTCGAGCTCCTGTAACTTTTATTCATTGCT-3′.预期扩增片段长度为219 bp.

1.2.3干扰片段的扩增以全长cDNA序列为模板进行PCR扩增.反应条件为:热启动;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃ 10 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,无非特异性条带,则直接进行后续试验.

1.2.4RNA干扰(RNAi)植物表达载体的构建将PCR产物连接到T载体,获得T-ZmSUT4,将T-ZmSUT4转化大肠杆菌DH5α,于37 ℃暗培养12~16 h,进行蓝白斑筛选;挑取白色单菌落,进行PCR检测,将含有目标克隆的单菌落于 37 ℃ 摇菌过夜,送公司测序.提取包含正确序列T载体的质粒,用XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切表达载体pGreen-HY104、T-ZmSUT4质粒,回收酶切产物;用T4-DNA连接酶过夜连接,将干扰片段反向插入表达载体中,得到HY104-A,用其转化大肠杆菌,Kan抗性筛选目标克隆,提取质粒验证;用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4,回收酶切产物,过夜连接得到HY104-A-S(图1),转化大肠杆菌,Kan抗性筛选目标克隆,提取质粒,用EcoRⅠ进行验证.

1.2.5RNAi植物表达载体转化农杆菌EHA105采用冻融

法[6]将构建好的RNAi植物表达载体HY104-A-S转化含有pSoup质粒的农杆菌EHA105感受态细胞,涂于含有Rif(50 μg/mL)、Kan(100 μg/mL)的LB固体培养基上,28 ℃暗培养2 d.挑取阳性菌落,进行菌落PCR鉴定.

2结果与分析

2.1干扰片段的PCR扩增

以玉米ZmSUT4基因的cDNA序列为模板,利用携带酶切位点的特异引物进行PCR扩增,电泳检测扩增产物.由图2可知,本试验得到219 bp的片段.将该片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,菌落经PCR鉴定后,将阳性克隆送公司测序,测序结果与黄早四cDNA序列完全一致(图3).

2.2RNAi表达载体的构建

提取T-ZmSUT4、pGreen-HY104载体的质粒,用 XhoⅠ、EcoRⅠ对2种质粒进行双酶切,结果见图4,胶回收连接后转化到大肠杆菌DH5α中,Kan抗性筛选目标克隆,对菌落进行PCR鉴定.提取正确克隆的质粒HY104-A,利用BamHⅠ、PstⅠ酶切载体HY104-A、T-ZmSUT4,结果见图5.回收酶切产物,连接后得到HY104-A-S,转化大肠杆菌,Kan抗性筛选目标克隆,提取质粒验证,利用EcoRⅠ酶切该质粒,预测应得到约1 000 bp的小片段.图6电泳结果与预期一致,表明植物表达载体HY104-A-S构建正确.

2.3表达载体转化根瘤农杆菌

分别以阳性对照质粒HY104-A-S和含有表达载体的农杆菌菌落为模板,利用特异性引物进行PCR扩增.经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定表明:含有表达载体的农杆菌菌液所得条带正确(图7),表明HY104-A-S载体质粒已转入含pSoup质粒农杆菌EHA105中.

3讨论

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源或外源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)高效特异性降解与

其高度同源的mRNA,有效地阻断目的基因的表达,从而获得功能缺失的突变体,因此该技术可作为研究基因组功能、创造分子育种新材料的有效手段.目前,RNA干扰技术已在玉米、水稻、大麦、小麦、大豆和马铃薯等作物中成功应用[7-13].Wesley等研究发现,双链RNA的长度影响目的基因的沉默效率,干扰片段长度在98~853 bp之间时基因沉默效率较高[14-15].此外,在插入的正向与反向干扰片段之间应有适当长度的间隔序列,以便RNAi表达载体在转入玉米后形成含有发夹结构的dsRNA,进而干扰ZmSUT4基因的表达.

Chincinska等利用RNA干扰技术研究发现,与野生型植株相比,马铃薯StSUT4-RNAi植株源叶中蔗糖输出增加,促使蔗糖、淀粉在块茎等库器官大量积累,进而引起块茎产量增加[16-17].本研究成功构建了玉米ZmSUT4基因的RNAi植物表达载体,不但为探究ZmSUT4基因表达在源库互作中的功能奠定了基础,还为进一步研究蔗糖运输、分配的调节机制提供理论依据,也为利用转基因技术调节蔗糖的运输、分配,从而提高玉米籽粒产量提供参考.

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植物论文参考资料:

该文结束语,此文为关于表达载体和ZmSUT4和玉米方面的植物论文题目、论文提纲、植物论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。

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